槐耳醇提取物联合西仑吉肽调控整合素β5抑制胃癌细胞转移的机制研究目的建立从槐耳醇粗提取物中富集有效成分的方法,并评估槐耳醇提取物(TMTF)有效成分的药物毒性和抑制肿瘤转移效果。重点围绕TMTF抑制胃癌转移作用靶点,聚焦其联合西仑吉肽调控整合素β5阻滞细胞上皮间质转化(EMT)相关信号通路的机制。为中药联合整合素类抑制剂的抗肿瘤原理提供理论基础。方法1.槐耳醇粗提取物纯化实验:通过柱层析方法和超声-乙醇萃取法,富集黄酮类化合物,并以芦丁为标准品,采用NaNO2-Al(NO3)3法测定含量。2.急性毒性评价试验:选取野生型AB品系斑马鱼一次性给予TMTF 25μg/mL,第3天观察斑马鱼各器官的反应情况,以确定毒性发生率。3.胃癌的生长和转移抑制实验:显微注射CM-Dil标记的人胃癌细胞至2dpf正常野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内,同急性毒性评价试验给药,培养至5 dpf,荧光强度评价槐耳提取物对胃癌细胞生长和转移抑制的作用。4.细胞克隆形成、增殖、迁移、侵袭实验:借助CCK8试剂、划痕插件和细胞小室,观察胃癌细胞在TMTF药物作用下的细胞克隆大小和数量、细胞增殖速度、迁移距离和细胞穿膜数量,评价药物作用效果。5.免疫印迹实验:裂解后收集TMTF等药物作用下的存活细胞,经电泳、转膜、孵育抗体等步骤,确认整合素β5等蛋白的表达差异,确定药物作用靶点。结果1.经纯化的TMTF中总黄酮含量均超过50%。2.TMTF未见明显靶器官的毒性,主要毒性表型为卵黄囊吸收延迟等发育影响。3.TMTF主要抑制胃癌细胞转移,对胃癌细胞生长抑制不明显。4.整合素β5高表达促进细胞增殖、迁移和侵袭。TMTF和西仑吉肽能够有效抑制其作用。5.TMTF作用抑制整合素β5、ILK、FAK磷酸化以及EMT相关蛋白,TMTF联合西仑吉肽作用增强抑制作用。结论富集纯化后的TMTF主要成分为总黄酮,其在抗胃癌细胞转移和低毒性方面具有优势。体外实验证实,TMTF能够抑制整合素β5、ILK、FAK磷酸化以及EMT相关蛋白的表达,进而抑制EMT进程。当TMTF联合西仑吉肽作用时,阻滞胃癌细胞转移效果更为显著。