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叶绿体基因转录后的调控包括RNA的编辑、内含子的剪接、3和5-UTR的加工、稳定以及翻译等过程,其中,核基因编码的蛋白因子在这些过程中扮演重要角色,比如PPR蛋白、APO蛋白、PORR蛋白等。然而,这些蛋白因子参与叶绿体基因表达的机理尚有待于阐明。本研究以两个株系白化突变体为研究材料,克隆到两个参与叶绿体基因表达的核基因,并进行了功能研究。主要结果如下:第一部分工作的研究结果: (1)我们通过280 Gy的60Coγ射线诱变粳稻(Oryza sativa ssp.Japonica)品种9522筛选到一个白化突变体apo2。该突变体不能光合自养,电镜结果显示其叶绿体发育异常。亚细胞定位实验证明该基因编码的蛋白定位于叶绿体。 (2)Osapo2基因突变导致叶绿体蛋白水平严重降低至检测不到,同时RNA转录水平也严重降低,而且核糖体缺失非常严重,说明该突变严重影响了叶绿体的翻译系统。 (3)BlAST分析表明水稻和拟南芥各有4个apo基因,apo1最先在拟南芥中发现,是一个RNA结合蛋白,参与叶绿体PSⅠ组装因子ycf3内含子2的剪接,而其它基因的功能并没有报道。RT-PCR实验结果显示,叶绿体基因atpF、ndhA、ndhB、petB、rpl2、rps12的内含子以及ycf3基因的第一个内含子不能剪接,而rpl16、petD基因的内含子剪接效率降低,同时ycf3基因的第2个内含子和基因rpsl6内含子的剪接正常,暗示着OsAPO2蛋白可能参与以上基因内含子的剪接过程。 (4)EMSA实验证实OsAPO2蛋白不仅可以和ycf3-intron1序列相结合,同时可以与rpl2内含子片段相结合,说明OsAPO2蛋白是一个RNA结合蛋白,该基因突变影响核糖体基因rpl2,rpl16内含子的剪接,导致成熟的mRNA缺失进而核糖体无法正常组装,最终导致叶绿体翻译系统严重受阻而影响叶绿体发育。 第二部分工作的研究结果: (1)在利用280 Gy的60Coγ射线诱变粳稻品种9522的突变体库中,分离到一个水稻白色致死突变体。利用图位克隆技术,结合基因预测,定位到一个突变基因Osalbl,该基因由于5个碱基的缺失突变导致基因移码。 (2)亚细胞定位和免疫印迹实验证明,OsALBL蛋白定位于叶绿体基质。透射电镜实验观察发现突变体中囊体膜发育畸形,基粒类囊体杂乱无章并呈无规则分布。蛋白免疫印迹实验表明突变体叶绿体蛋白整体水平明显低于野生型,有的叶绿体蛋白甚至检测不到,这说明该基因参与调控叶绿体基因蛋白表达。 (3) Osalbl基因的突变引起由质体编码RNA聚合酶(PEP)转录的光合基因转录水平下调,而使由核编码RNA聚合酶(NEP)编码的持家基因水平上调。通过Northern杂交试验我们发现核糖体大亚基蛋白编码基因rpl20出现转录后水平的异常加工,其前体在突变体中严重积累而成熟mRNA含量非常低,说明突变体中rpl20前体出现剪切缺失。进一步的研究证明突变体中rpl20的3-UTR加工异常,其3末端由于不能正常剪切形成成熟3末端(3-426,终止密码子后66nt)而其前体3-618(3末端,终止密码子后258nt)大量积累。这些结果表明,OsALBL作为一个PPR蛋白参与到rpl203-426到3-618 RNA区域的剪切加工步骤。 (4)通过EMSA实验证明OsALBL可以与3-258到3-618之间的RNA序列相结合。 综合以上结果,OsAPO2参与核糖体基因rpl2,rpl16内含子的剪接,导致成熟的mRNA缺失,蛋白缺失影响核糖体能够正常组装;而OsALBL参与rpl203-426到3-618的剪切加工,其突变导致成熟的rpl20 mRNA缺失影响核糖体能够正常组装。因此,OsAPO2和OsALBL都是影响叶绿体自身翻译机构的正常功能,在叶绿体基因表达中发挥重要的作用。