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消费者由于经济损失、食物过敏、宗教信仰和食品安全等因素,对肉类掺假越来越关注。肉类掺假在生肉和熟肉制品中都有很高的比例,在熟肉中的掺假比例高于在生肉中的掺假比例。生肉的鉴别方法已成熟,而熟肉制品的鉴别由于蛋白质在加热期间会产生变性、溶解度降低、丧失抗原性,难以鉴别。猪骨骼肌肌钙蛋白I是猪肉特有的蛋白质,可作为耐热种类标志蛋白鉴别熟肉制品的肉种类来源。本试验采用原核表达系统获得重组猪快骨骼肌肌钙蛋白I (TnI-fast),制备单克隆抗体和多克隆抗体,初步建立鉴别熟肉中猪肉成分的夹心ELISA方法,为鉴别熟肉制品中的种类掺假提供技术手段。主要研究结果如下：1.猪骨骼肌TnI-fast基因的克隆与表达利用本实验制备的质粒pMD18-T-TnI-fast,连接到表达载体pET-32a和pGEX-KG,构建了原核表达质粒pKG-TnI-fast和pET-32a-TnI-fast,并在E.coliBL21(DE3)中表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测表明诱导表达成功,经透析纯化后获得目的重组蛋白GST-Tnl-fast和His-Tnl-fast, Western blot结果表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。2.抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I多克隆抗体的制备与纯化将重组蛋白GST-Tnl-fast和His-Tnl-fast作为免疫原,免疫兔子,制备了兔抗GST-TnI-fast和His-Tnl-fast的血清,分别采用饱和硫酸铵粗提和Sephadex G-200过柱纯化血清,获得抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I多克隆抗体。3.抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备与纯化将重组蛋白GST-Tnl-fast和His-TnI-fast作为免疫原,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经过细胞融合和克隆,用纯化好的His-Tnl-fast和GST-Tnl-fast作为筛选抗原筛选,获得了四株能稳定分泌抗TnI-fast蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D7、2B2、3C3、2F4。腹水ELISA效价均在1：0.8×106以上,经过辛酸硫酸铵法获得了纯度较高的单抗。4.检测猪肉的夹心ELISA方法的建立以纯化的抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体作为捕获抗体,抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I多克隆抗体作为检测抗体,建立检测熟肉中猪肉成分的的夹心ELISA。单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度均为8μg/mL,特异性好,灵敏度高,最低能检测到0.50%的掺杂,重复性好。5.对市售熟肉制品的测定市场购买熟肉制品,用夹心ELISA方法测定其中是否含猪肉成分。用组织基因组DNA提取试剂盒提取夹心ELISA实验中检测含猪肉的掺假样品的基因组。按照GB T21101-2007和SN T1119-2002的标准进行PCR-RFLP,二者阳性符合率为100%。