论文部分内容阅读
目的1.研究细胞周期调控蛋白p27kip1及其相关分子JAB1在肝细胞癌(human hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达,并结合增殖指标Ki67和临床病理资料初步探讨p27及JAB1与HCC发生发展的关系。2.克隆人类p27kip1基因,构建其真核表达载体。3.研究化疗药物三氧化二砷(As2O3)对肝癌细胞活性、细胞周期及细胞凋亡的影响,初步探讨p27kip1及JAB1在此过程中的作用。方法1.首先在组织水平,选取76例HCC及癌旁组织,l0例肝血管瘤旁肝组织病例标本,10例HCC及癌旁肝新鲜组织,采用免疫组化,10例新鲜组织中有6例采用免疫印迹(Western blot)方法,检测p27kip1及其相关分子JAB1的表达情况,并结合增殖指标Ki67、PCNA和临床病理资料初步探讨p27kip1及JAB1与HCC发生发展的关系。2.采用RT-PCR技术扩增人类p27kip1cDNA全长序列,通过DNA重组技术将其重组于pcDNA3.1及pEGFP-N2载体,构建p27kip1正、反义真核表达质粒及p27-EGFP融合蛋白表达质粒,通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。3.以WST-1法、流式细胞术及Hochest染色法检测三氧化二砷对人肝癌SMMC-7721细胞活性、细胞周期及细胞凋亡的影响, Western blot技术检测p27kip1分子网络中主要成员在此过程中的表达变化,运用细胞免疫荧光技术检测p27kip1相关分子在药物作用后亚细胞定位的变化。结果1.肝癌和癌旁组织免疫印迹结果显示,p27kip1主要在癌旁高表达,而JAB1蛋白在大部分HCC组织中的表达高于对应癌旁肝组织。免疫组化结果显示:JAB1在HCC中的表达高于癌旁组织和血管瘤旁肝组织。JAB1的表达与肝癌组织分化程度,血清AFP值及转移相关。p27kip1在正常肝组织和癌旁组织中的表达高于HCC组织,表达强度与肝癌组织分化程度,血清AFP值、坏死程度及转移相关。相关性分析表明HCC组织中JAB1蛋白表达与p27kip1蛋白表达呈负相关,与ki67表达正相关,p27的表达与ki67呈负相关。2.构建p27kip1正、反义真核表达质粒及p27-EGFP融合蛋白表达质粒,通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定,证实构建成功。3.三氧化二砷能够抑制肝癌SMMC-7721细胞生长活性,小剂量三氧化二砷可诱导肝癌细胞发生G2/M期生长阻滞,大剂量可诱发细胞凋亡;随As2O3作用时间的延长,SMMC-7721中p27kip1表达增加,CDK2、CRM1、JAB1等蛋白表达下降。免疫荧光结果显示,加药刺激后,p27kip1发生从胞浆向胞核的易位,伴有JAB1胞浆向胞核的易位,CRM1的胞浆定位变化不明显。。结论1. p27kip1蛋白表达的降低、JAB1表达的增高与HCC的发生及肿瘤恶性程度密切相关。JAB1蛋白的表达与p27kip1负相关,与ki67正相关,提示JAB1在HCC组织中表达上调,可能是通过作用于细胞周期调控蛋白p27kip1,加速了p27kip1的出核降解,使其表达及代谢发生异常。导致细胞周期失控并促进细胞异常增殖,从而参与了HCC的发生和发展。2.成功构建了人类p27kip1基因的正、反义真核表达质粒和p27-EGFP融合蛋白表达质粒,为进一步探讨p27kip1基因在肝癌发生中的作用奠定了实验基础。3.三氧化二砷能够抑制肝癌细胞活性,引起细胞周期阻滞或凋亡,上调p27kip1蛋白表达,下调CRM1、JAB1等蛋白表达,同时伴有p27kip1相关分子亚细胞定位的改变。提示,CRM1、JAB1可能通过加速p27kip1的降解、改变p27kip1的亚细胞定位来影响p27kip1的功能,参与As2O3对SMMC-7721细胞生长抑制的分子调控机制。