本研究以海栖热袍菌（Thermotoga maritima）MSB8菌株基因组DNA为模板,通过PCR获得木聚糖酶（XylanaseB）基因mxynB₆₄和mxynB₅₇₇。经与Karen E.Nelson等人在GertBank中注册的木聚糖酶基因xynB（AF100063）进行同源性比较得知,mxynB₆₄的第64位碱基由腺嘌呤（A）转变为鸟嘌呤（G）,因此,该基因产物的第22位氨基酸由原来的天冬酰胺（Asn）转变为天冬氨酸（Asp）;而mxynB₅₇₇的第577位碱基由胸腺嘧啶（T）转变为胞嘧啶（c）,该基因产物的第193位氨基酸也由原来的酪氨酸（Tyr）转变为组氨酸（His）。将木聚糖酶基因mxynB₆₄克隆至表达载体pET-28a（+）,转化大肠杆菌。该基因可在大肠杆菌细胞内高效表达。其表达产物具有酶活性高、耐90℃高温、纯化方便等特点,采用RBB-木聚糖法测定酶活为121.6U/mg蛋白,但其表达产物不能分泌至细胞外。 分别将木聚糖酶基因mxynB₆₄和mxynB₅₇₇克隆至表达载体pPIC9K,通过转化整合至巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌株基因组中。摇瓶培养发现,重组木聚糖酶mXynB₆₄和mXynB₅₇₇分泌表达量较高,在甲醇诱导培养108小时后,胞外木聚糖酶酶活分别可达到0.6U/ml和0.5U/ml,并具有良好的酶学性质。两种重组木聚糖酶的最适反应温度分别为90℃和80℃,并在pH 5.0-10.8范围内稳定,推测该酶的第193位氨基酸残基仅与酶的耐热性有关,并不影响其pH稳定性。在5升自动发酵罐上对毕赤酵母重组菌株GS115-9K-mxynB₆₄Ⅱ进行高密度甲醇诱导产酶培养,经108小时培养后其细胞密度可达OD₆₀₀=144,酶活水平达到6U/ml,高于摇瓶水平10倍,适于工业化应用。 本实验通过PCR分别获得了多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）中的3个启动子序列,并将酿酒酵母α因子分泌信号肽序列和整合外源基因(mxynB₆₄)的rDNA序列组合,成功构建四种可在大肠杆菌和汉逊酵母中穿梭表达的载体,包括含有诱导型启动子的pMOXp-mxynB₆₄（10.6Kb）,pFMDP-mxynB₆₄（9.7Kb）,pAOX1p-mrynB₆₄（9.8Kb）和含有组成型启动子的pPMA1p-mxynB₆₄（11.1Kb）。将它们分别转化并整合至多形汉逊酵母A16菌株基因组中,摇瓶培养发现,重组耐高温木聚糖酶的分泌表达量比毕赤酵母略低,在摇瓶培养诱导108小时后,多形汉逊酵母重组菌株中,具有诱导型启动子的菌株A16-pMOXp-mxynB₆₄胞外木聚糖酶活力最高,达0.25U/ml,但比毕赤酵母菌株GS115-9K-mxynB₆₄Ⅱ的分泌水平低一倍。在7.5升自动发酵罐上的高密度培养结果证明,组成型表达的汉逊酵母菌株A16-pPMA1p-mxynB₆₄具有不需要甲醇诱导、生长迅速的特点,具有工业化应用的潜力。