【研究背景】膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来,我国膀胱癌的发病率逐年升高,而且它是一种没有明显症状,容易复发的疾病。褪黑素是松果体内分泌的吲哚胺激素,之前的研究发现它能通过不同途径体外、体内抑制胃癌、结肠癌、骨肉瘤的生长,在膀胱癌中的研究较少。本研究探讨褪黑素对膀胱癌细胞(T24和UMUC-3)增殖、凋亡、侵袭和迁移的调节作用,此外细胞朊蛋白(Cellular prion protein,PrPC)是一种由糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上的细胞表面蛋白,在神经、肌肉和心脏等多种组织的细胞中高度表达。已有研究表明,PrPC在多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移和耐药中起重要作用。已有研究表明褪黑素通过下调PrPC而抑制结肠癌细胞增殖和促进凋亡,但其在膀胱癌中的作用机制尚未完全阐明。总之,该文章的主要研究目的是为了进一步探讨褪黑素对膀胱癌细胞的作用以及在此过程中LKB1-AMPK-m TOR信号通路是否具有调控作用,以及PrPC敲除后膀胱癌细胞对褪黑素处理后的变化,从而探讨PrPC在此中间起到的作用。【研究方法】1.细胞培养,膀胱癌细胞株T24和UMUC-3,培养于DMEM培养基中,细胞株用不同浓度的褪黑素分别处理后,检测细胞的生长能力。2.使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(Becton Dickinson)评估细胞凋亡程度。简而言之,用胰蛋白酶(Hyclone)分离细胞,然后用FITC annexin V染色,使用FACScanto II细胞细胞仪(Becton Dickinson)分析。3.使用Transwell小室,对细胞进行相关操作,用以检测褪黑素对细胞迁移侵袭能力的探究。3.质粒构建和瞬时转染,特异性PrPC-si RNA用来转染糖T24和UMUC-3膀胱癌细胞株。4.Western blot检测褪黑素处理膀胱癌细胞前后细胞中的PrPC、LKB1、AMPK、m TOR、BAX、caspase3和Bcl-2蛋白的表达情况。【研究结果】1.我们在对膀胱癌细胞进行褪黑素处理后,发现了褪黑素明显抑制了膀胱癌细胞的生长能力,在一定浓度范围内,随着浓度升高,抑制能力也随之上升。2.为了研究褪黑素对膀胱癌细胞的凋亡影响,我们采取了流式细胞学的方法进行检测,发现褪黑素处理膀胱癌细胞株后,凋亡也随之增加。此外,利用蛋白免疫印迹方法发现凋亡蛋白在褪黑素处理后的膀胱癌细胞中的表达强于未处理的膀胱癌细胞中的表达;3.为了探究褪黑素对膀胱癌细胞的侵袭迁移影响,使用了Transwell小室进行操作,发现经过褪黑素处理后的膀胱癌细胞侵袭迁移能力均减弱。3.我们进一步研究发现在膀胱癌细胞中经过褪黑素处理后,PrPC的表达下降,LKB1-AMPK-m TOR通路得到激活,在此,为了排除其他可能的未知因素影响,对两者间的作用相关性产生干扰。我们从基因表达降低了后者的表达水平,即利用特异性si RNA敲低PrPC,最终结果发现LKB1和AMPK的表达量也相应升高,m TOR的表达量相应减少;以上结果表明PrPC抑制了了AMPK的活化,说明PrPC通过LKB1-AMPK-m TOR信号通路促进膀胱癌细胞的生长和增殖,而褪黑素可以抑制这一效应。【结论】1.褪黑素可以抑制膀胱癌生长、侵袭迁移,促进凋亡。2.褪黑素可以通过诱导PrPC下调活化LKB1-AMPK-m TOR信号通路,从而促进膀胱癌细胞的凋亡。