野菊花为我国沿用历史悠久的大宗药材,现为多种中成药的主要成分如三九感冒灵、野菊花颗粒、野菊花栓及野菊花注射液等。野菊花为广布种,主要分布于我国的东北、华北、华中、华南及西南等地,资源虽然较丰富,但随着中药材产业规模化、规范化的发展,医药市场对野菊花的优质资源的需求也越来越大。为扩大野菊药用部位,提高其药用价值,本论文对野菊中最主要活性成分萜类化合物（以挥发性萜类为主）和黄酮类化合物在植株不同组织的分布进行了研究和比较,包括其药用部位花、花蕾及其他器官根、茎、叶。同时对各组织进行转录组测序,筛选出了萜类及黄酮类生物合成途径相关酶基因,分析野菊不同组织部位的活性成分分布及相关合酶基因表达模式,并对相关基因CiIPPI1,CiIPPI2和CiFNSⅡ进行克隆和功能分析。以进一步认识野菊中次生代谢产物的分布规律和合成机制,为开发野菊更多药用部位提供实验基础,对野菊资源更好的利用具有一定的理论意义。目的:本文拟对野菊不同组织部位的萜类和黄酮类成分含量、两者相应合成通路的关键酶基因的表达量、及成分含量与基因表达量的关联开展研究,从化学成分表型和成分的合成代谢途径基因水平为野菊扩大药用部位提供科学理论支撑和技术方案,同时还可为研究野菊不同组织中活性成分积累和调控机制提供科学基础。方法:1 萜类和黄酮类化合物在野菊不同部位的分布对野菊根、茎、叶、花、花蕾五个部位进行次生代谢产物检测,运用GC-MS检查挥发性萜类含量,采用HPLC测定黄酮类的含量。2野菊不同部位转录组研究及生物合成途径分析通过二代测序及生物信息学技术对野菊花五个部位进行转录组学分析,重点分析次生代谢产物合成途径的相关基因及不同部位的差异基因。对萜类和黄酮合成路径关键基因进行注释,并筛选关键酶基因IPPI和FNS的候选ungiene。3挥发性萜类、黄酮类与相关unigene的相关性分析结合次生代谢产物挥发性萜类与黄酮类的检测结果,与转录组数据中相关unigene表达量进行相关性分析,构建网络分析模型,挖掘出与次生代谢产物密切相关的调控基因。4 IPPI在野菊不同部位的表达、亚细胞定位及功能鉴定通过RT-qPCR技术检测CiIPPI1,CiIPPI2基因在野菊五个组织部位中的基因表达量,并构建pET32a（+）原核表达载体,在E.coli Rossetta（DE3）中表达重组蛋白,用Ni-NTA柱纯化获得目的蛋白。分别以IPP和DMAPP为底物,进行体外酶促反应,进行体外酶功能验证。使用GC-MS检测产物,确认目的基因的功能。构建带EGFP荧光标签的植物表达载体,将目的基因转化至烟草原生质体和烟草植株中,观测两个基因的不同亚细胞定位。5 FNSⅡ在野菊不同部位的表达及功能鉴定通过RT-qPCR技术检测OFNSⅡ基因在野菊五个组织部位中的基因表达量,并构建CiFNSⅡ基因的酵母表达载体,转化至Saccharomyces cerevisiae WAT11菌株中,进行目的基因编码蛋白的酵母异源表达。利用Western blot技术检测目的蛋白的表达情况,获得重组蛋白后,分别以3种不同的黄烷酮为底物,进行体外酶功能验证。运用LC-MS高分辨质谱检测产物,确认目的基因的功能。结果:1萜类和黄酮类化合物在野菊不同部位的分布分别提取了野菊根、茎、叶、花、花蕾五个部位中的活性成分,使用GC-MS检测到了挥发性萜类化合物共40种,其中根中12种,茎中9种,叶中17种,花中23种,花蕾中26种。使用HPLC-MS在不同部位共检测到了六种黄酮类化合物,其中花中6种,花蕾、根、茎中各5种,茎中3种。对野菊五个部位的代谢物进行分析,结果显示花和花蕾所含有的挥发性萜类和黄酮类的种类及含量都高于根、茎、叶,这一发现证实了传统中药中使用花作为药用部位是具有一定科学基础的。然根、茎、叶亦有部分独有的成分及含量高于花、花蕾的化合物。此外,蒙花苷在根、茎中的含量均高于药用部位花、花蕾中的含量,这一发现为扩大野菊的药用部位提供了参考。2野菊不同部位转录组研究及生物合成途径分析对野菊根、茎、叶、花、花蕾五个部位进行转录组测序,经初步组装后,共获得89,206条unigene.通过Nr、Swissprot、GO、KEGG等数据库进行注释,共有54,171个unigene获得注释,注释率为60.7%,其中有15,941个unigene被四个数据库同时注释。获得了萜类生物合成相关途径的unigene 311个及黄酮类生物合成相关的unigene 103个,并进一步通过同源比对和系统进化分析,筛选获得萜类合成关键酶异戊烯基焦磷酸异构酶（isopentenyl diphosphate isomerase,IPPI）候选基因2条及黄酮合成关键酶黄酮合成酶（flavone synthase,FNS）基因 1 条。3挥发性萜类、黄酮类与相关unigene的相关性分析3.1挥发性萜类与黄酮类的相关性有四个黄酮类化合物与16个单萜、23个倍半萜化合物具有较显著相关性。3.2挥发性萜类与unigene的相关性通过皮尔森相关性分析,筛选得到与萜类化合物含量呈正相关的大量萜类合成相关基因及少量呈负相关的基因,表明萜类化合物的合成受相关unigene表达的调控。3.3黄酮类与unigene的相关性通过皮尔森相关性分析,筛选得到大量与黄酮类化合物含量或呈正相关或呈负相关的黄酮合成路径基因,表明黄酮类化合物的合成受相关unigene表达的调控。4 IPPI在野菊不同部位的表达、亚细胞定位及功能鉴定4.1 IPPI1/2在野菊不同组织中的表达量通过RT-qPCR方法,检测所得的两个IPPI基因在野菊根、茎、叶、花、花蕾五个组织中表达模式均与转录组表达模式呈基本一致的趋势。CiIPPI1在野菊不同组织部位的表达总量为:根>叶>花>花蕾>茎,主要在根和叶中表达,特别是在根中高表达,在茎中表达量很少。CiIPPI2在野菊不同组织部位的表达总量为:花>花蕾>根>茎>叶,主要在花和花蕾中显著表达,特别是在花中高表达,其他组织的表达水平相对较低。总体来看,CiIPPI2表达量比CiIPPI1更高,CiIPPI2的最高表达量（花中）为CiIPPI1最高表达量（根中）的三倍以上。4.2序列分析及克隆CiIPPI1编码区序列共864 bp（其中转运肽序列共186 bp）,编码287 aa的氨基酸。CiIPPI2编码区序列共699 bp（其中转运肽序列共18 bp）,编码232 aa的氨基酸。以Gateway克隆的方法获得重组质粒pENTR/D-CiIPPI1,pENTR/D-CiIPPI2。4.3蛋白表达使用pET32a载体在大肠杆菌DE3中成功表达了 tpCiIPPI1与CiIPPI2并纯化获得了重组蛋白。4.4蛋白功能验证（1）CiIPPI1在反应30 min后达到稳态,CiIPPI2则在反应2h后达到稳态。可得知CiIPPI1催化速率较CiIPPI2快。（2）CiIPPI1正逆反应均可使DMAPP:IPP维持在约4:1的比率。CiIPPI2在以IPP为底物时,使DMAPP:IPP维持在约1:1的比率;在以DMAPP为底物时,使DMAPP:IPP维持在约5:1的比率。可得知CiIPPI1与CiIPPI2对IPP/DMAPP的亲和力各不相同,它们不同的调控比率可能通过影响下游FPP、GPP、GGPP的生成比率的变化,从而进一步影响后续所合成的萜类种类的变化。4.5亚细胞定位野生型的烟草原生质体细胞在无荧光信号,而无定位功能的对照空载体EGFP control的荧光信号在细胞质和质体均有分布。（1）CiIPPI1的ORF带有较长的转运肽序列,经预测其可能定位于质体,且主要作用于位于质体的MEP途径,实验结果可观察到CiIPPI1-EGFP使原生质体的叶绿体发出荧光信号,与推测的定位一致。（2）CiIPPI2所含有的转运肽序列较短,经预测其可能定位于细胞质,并主要作用于位于细胞质的MVA途径,实验结果可观察到CiIPPI2-EGFP使原生质体中的细胞质发出荧光信号,与推测的定位一致。5黄酮生物合成关键酶基因FNSⅡ功能研究5.1 CiFNSⅡ在野菊不同组织中的表达模式用RT-qPCR方法,比较CiFNSⅡ在五个组织部位的表达水平,发现其在花和花蕾中表达量较其他部位高,该结果也与转录组中该基因的表达趋势一致,表明在黄酮类化合物含量较高的部位,其关键合酶基因的表达也更活跃。5.2 CiFNSⅡ序列分析与克隆CiFNSⅡ基因编码区序列共1545bp,编码514aa氨基酸,通过序列比对,发现CiFNSⅡ与多个flavone synthase Ⅱ具有高度的同源性,具有P450基因的保守结构域,属于CYP93B亚家族。通过Gateway克隆获得了 CiFNSⅡ编码区全长序列,并构建了真核表达载体pESC-URA-CiFNSⅡ。5.3 CiFNSⅡ酶功能鉴定通过酿酒酵母WAT11成功表达并获得了 CiFNSⅡ重组蛋白,使用Western blot检测到诱导8小时后可产生较多蛋白。在体外进行酶促反应,在辅因子NADPH的共同作用下,CiFNSⅡ可利用黄烷酮柚皮素（naringenin）,圣草酚（eriodictyol）,甘草素（liquiritigenin）为底物,产生对应的黄酮芹菜素（apigenin）,木犀草素（luteolin）,7,4’-二羟基黄酮（7,4 ’-dihydroxyflavone）。结论:本论文对野菊五个组织（根、茎、叶、花、花蕾）中的活性成分挥发性萜类和黄酮类进行了含量检测,同时结合各部位的转录组数据重点探究相关生物合成路径,分析野菊不同组织部位的活性成分分布及相关合酶基因表达模式,并对关键酶基因进行克隆和功能分析,进一步认识了野菊中次生代谢产物的分布规律和合成机制。这些结果为开发野菊更多药用部位提供一定的理论基础,并为野菊的合理种植与利用及其资源更好的开发提供新的研究思路。