论文部分内容阅读
目的:观察C-Maf诱导蛋白(C-Maf inducing protein,CMIP)对人神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响,探索CMIP基因在其发挥作用中与MDM2基因的相互影响及调控关系。检测在神经胶质瘤患者病理组织中CMIP蛋白的表达情况,分析其意义。方法:本研究主要通过体外细胞实验和临床病理实验进行验证。1、体外细胞实验:(1)采用三种神经胶质瘤细胞(A172、U251和H4),通过实时荧光定量PCR实验(RT-qPCR)检测CMIP的信使RNA(mRNA)在这三种神经胶质瘤细胞中的表达水平。(2)通过对高表达CMIP的人神经胶质瘤细胞A172中用siRNA方法敲低CMIP的表达水平,在低表达CMIP的人神经胶质瘤细胞U251中通过转染CMIP过表达质粒方法提高CMIP的表达水平。利用MTT法和细胞克隆形成实验评价细胞增殖能力和细胞活力;采用流式细胞术实验检测A172细胞在转染CMIP-siRNA前后的凋亡变化;利用trsnswell小室进行细胞迁移实验和细胞侵袭实验检测。(3)通过Western Blot实验,在神经胶质瘤细胞A172和U251中检测CMIP被敲低或过表达情况下,检测MDM2基因表达水平的变化,作为CMIP下游调控基因进一步探索。2、CMIP表达的临床病理研究:收集99例神经胶质瘤患者肿瘤组织标本和59例正常瘤旁中枢神经组织标本,所有标本均经10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋。这些患者除患有神经胶质瘤疾病以外未被检测出其他相关颅内疾病,在被手术切除肿瘤之前也未经历其它的治疗方案,避免了因其它疾病或治疗可能对本实验造成的干扰。同时收集这些患者详细的临床各相关参数,包括年龄、性别、KPS评分、肿瘤的恶性分级和患者治疗后的无复发生存期(RFS)及整体生存期(OS)。临床参数的收集参照国际卫生组织的神经胶质瘤分级标准,87例患者术后随访时间均超过了24月。在课题实验进行之前,实验的设计和应用征得患者或患者家属的同意。实验设计得到了伦理学委员会的认可。(1)应用免疫组织化学实验检测了CMIP在各胶质瘤肿瘤组织中的表达水平,与瘤旁正常神经胶质组织进行比较。(2)应用免疫组织化学技术检测相同病例MDM2的表达水平,分析其与CMIP基因之间的关系。(3)分析CMIP在神经胶质瘤组织中的表达和临床病理学参数的相关性,这些参数包括患者的年龄、性别、组织分级和KPS评分。(4)根据神经胶质瘤组织的CMIP表达水平的高低与患者无复发存活率(recurrence free survival rate,RFS)及整体存活率(overall survival rate,OS)的关系绘制Kaplan-Meier曲线,进行相关性分析。结果:1、体外细胞实验:(1)通过实时荧光定量PCR实验(RT-qPCR)检测了人神经胶质瘤细胞H4、A172和U251中CMIP的mRNA的水平。在这三种神经胶质瘤细胞中,A172细胞表达CMIP的mRNA水平最高,H4细胞表达CMIP的mRNA水平中等,而U251细胞表达CMIP的mRNA水平最低(H4:1.00±0.11,A172:2.21±0.18,U251:0.38±0.04,P<0.05)。(2)MTT细胞活力检测实验结果显示,在A172细胞中,96小时的实验周期内,转染CMIP-siRNA的细胞相对于转染siRNA阴性对照的细胞细胞活力显著降低(OD490值,1.01±0.06 vs.0.71±0.09,P<0.05);而在U251细胞中,在96小时的实验周期内,转染pIRESneo3-CMIP的细胞相对于转染pIRESneo3阴性对照质粒的细胞细胞活力显著增加(OD490值,1.11±0.12vs.0.78±0.08,P<0.05)。(3)与之相一致,CMIP-siRNA显著降低了A172细胞的细胞克隆形成数(从45.2±9.8个降低到23.2±5.2个,P<0.05);pIRESneo3-CMIP显著增加了U251细胞的细胞克隆形成数(从24.7±4.5个升高到47.8±8.3个,P<0.05)。(4)流式细胞术实验显示,在A172细胞的阴性对照组中,细胞凋亡群体的比例是3.101%,而在CMIP-siRNA转染的细胞中,细胞凋亡群体的比例是4.423%(P<0.05)。(5)通过transwell细胞培养小室检测细胞迁移和侵袭实验进行检测人神经胶质瘤细胞A172和U251细胞的迁移侵袭能力,结合CMIP的敲低和过表达验证CMIP在其中发挥的作用。与对照组相比,转染了CMIP-siRNA的A172细胞的迁移能力和侵袭能力都显著降低,细胞迁移数量由171.6±3.2个降低到78.2±12.5个(P<0.05),细胞侵袭数量由149.3±9.6个降低到76.9±7.4个(P<0.05)。与此相一致,在U251细胞中,上调其CMIP基因的表达,细胞迁移能力和侵袭能力都明显提高,细胞迁移数量由42.2±4.8个升高到145.6±6.6个(P<0.05),细胞侵袭数量由48.3±4.2升高到176.4±3.9(P<0.05)。(6)在探索CMIP在人神经胶质瘤细胞中可能发挥促进增殖迁移能力的下游调控候选基因研究中,发现MDM2基因在A172细胞中,当CMIP通过CMIP-siRNA被敲低以后表达水平相应明显降低,而在U251细胞中当CMIP通过转染pIRESneo3-CMIP质粒提高表达量以后MDM2表达水平相应明显升高。2、人体组织标本观察(1)通过免疫组织化学实验,在99例神经胶质瘤组织标本中,38例CMIP阳性(38.4%),59例瘤旁正常神经胶质组织标本中,12例CMIP阳性(20.3%)。与瘤旁正常神经胶质组织相比,CMIP在神经胶质瘤组织中的表达水平显著增加,差异显著具有统计学意义(P<0.05)。(2)在高级别的神经胶质瘤组织中(III级和IV级)CMIP表达水平(30/59,50.8%),显著高于较低级别的神经胶质瘤组织(I级和II级)(8/40,20.8%),差异显著具有统计学意义(P<0.01)。(3)在相同99例神经胶质瘤组织使用免疫组化技术检测MDM2蛋白表达实验中,41例呈阳性表达(41.4%),MDM2蛋白主要定位于肿瘤细胞胞质。皮尔森相关性分析显示:MDM2和CMIP在神经胶质瘤中表达呈显著相关性(rs=0.433,P<0.01)。(4)CMIP表达水平的高低与患者的年龄、性别以及卡氏评分(Karnofsky performance score,KPS)没有表现出具有统计学显著性的差异(均P﹥0.05)。(5)从99例神经胶质瘤组织的CMIP表达水平的高低与患者无复发存活率(relapse-free survival,RFS)及整体存活率(overall survival,OS)的关系绘制了Kaplan-Meier曲线中,显示比较CMIP表达水平低的患者,CMIP表达水平高的患者表现出较低的无复发存活率RFS(P<0.05)和整体存活率OS(P<0.01)。结论:CMIP可促进人神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭,减少凋亡。CMIP的表达与神经胶质瘤组织的低分化和患者的低生存率一致,提示CMIP可以作为神经胶质瘤分化和预后的重要潜在标志物。MDM2可能参与了CMIP对人神经胶质瘤细胞增殖和迁移的调控。