论文部分内容阅读
本论文根据鸭疫里默氏杆菌(RA)的16S rDNA序列设计常规PCR引物，扩增出了838bp的预期片段，成功建立了能够特异检测RA的PCR方法，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、芽胞杆菌的检测呈阴性，最低能够检测到20fg的RA-DNA。 应用建立的PCR方法对四川地区健康鸭群及养鸭环境RA的携带情况进行分子流行病学调查，结果表明：健康鸭群及养鸭环境的饲料、饮水、垫料等是携带RA的重要场所。 根据我们实验室发现的RA荚膜多糖蛋白基因序列(DQ151838)，设计并合成荧光定量PCR引物和探针，建立了一种能特异性检测RA的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。该法标准曲线的表达式为Y=-3.416X+39.492，相关系数1.000，PCR循环效率96.2％，DNA拷贝数在10~0-10~8范围内扩增曲线有良好的线性关系，最低能够检测到RA的DNA模板数为2.0copies(相当于1个RA菌体)，比本论文所建立的常规PCR方法灵敏度高10~4倍，而对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的检测呈阴性；与RA人工感染致死雏鸭的心、肝、脑细菌分离的符合率为100％；对临床送检具有典型RA症状和病变的死亡雏鸭的肝脏、心血和脑组织的检出率显著高于细菌分离率。 应用建立的FQ-PCR方法对1／10LD50 RA感染雏鸭体内的动态分布的检测结果表明：RA感染雏鸭后2h即可在皮注组的心、肝、肺、胸腺、食道，口服组的食道、气管、十二指肠、咽喉拭子，滴鼻组的心、肝、食道、气管、十二指肠、肺、胸腺、咽喉拭子中检测到RA核酸；感染4h后，各组除了脑和血液(口服组的胰腺也未检测出RA)，其它所有采集的样品中均检测到了RA核酸的存在；感染8h后，除了口服组的脑外，其它所有样品均检测到了RA核酸。心、肝、胸腺RA含量最高，其次是肺、肾、脾和法氏囊，脑和胰腺是含量相对较低的器官。