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骨形态发生蛋白6(BMP6)是卵泡内由卵细胞和颗粒细胞分泌的一种重要的生长因子,是TGF-b超家族的成员之一。BMP6在调节卵泡的发育和功能方面起着重要的作用。卵泡发育过程中,BMP6表达发生变化。从初级卵泡发育开始,BMP6表达逐渐增加,在卵泡发育过程中逐渐增多,在优势卵泡中表达降低,而在排卵后又逐渐恢复。在小鼠体内,使用基因敲除技术特异性敲除BMP6可以导致小鼠排卵率降低,卵子质量下降,影响胚胎的种植率,并且导致小鼠产仔数下降。大鼠的体外研究显示,BMP6可以降低由卵泡刺激素(FSH)诱导的环腺苷酸(c AMP)的活性、孕酮的生产以及和孕酮产生相关的酶的活性,如类固醇激素合成急性调节蛋白(St AR)和胆固醇侧链裂解酶(P450scc)。在人颗粒细胞中,BMP6促进抗苗勒氏管激素(AMH)和卵泡刺激素受体(FSHR)的生成,同时降低St AR的表达。在人黄体中,BMP6可以抑制孕酮的生成,并且在黄体退化的过程中生成减少,因此被认为是调节黄体退化的重要因子。综上,BMP6对卵子的成熟及卵巢黄体功能的调节,都起到了重要的作用。博士实验课题针对BMP6对卵巢内尤其是卵泡发育以及黄体形成有重要作用的因子进行研究。1.BMP6抑制人颗粒细胞中GDNF的表达胶质细胞源神经营养因子(GDNF)是表达在卵巢内的一种神经因子,在调节卵子成熟方面起到重要的作用。【实验目的】:研究在人类颗粒细胞中,BMP6对GDNF的调节及其机制。【实验方法】:实验使用已经建立起来的一永生化的人颗粒细胞(SVOG)和原代人颗粒细胞(h GC)。【结果】:在SVOG和h GC细胞中,BMP6可以显著下调GDNF的表达。利用两种抑制的方法(激酶受体抑制剂和小干扰RNA),我们发现BMP6下调GDNF表达的过程中,通过两种I型受体(ALK2和ALK3)。实验中发现,BMP6下调GDNF表达的过程中诱导SMAD1/5/8和ERK1/2的磷酸化,但不诱导P38和AKT的磷酸化。进一步研究表明,在SMAD1/5/8中,BMP6诱导SMAD1和SMAD5的磷酸化。此外,当同时敲除SMAD4和ERK1/2时,BMP6对GDNF的抑制作用被减弱。这说明,SMAD通路和ERK通路在BMP6对GDNF的抑制作用过程中都起到了作用。【结论】:由卵细胞及颗粒细胞分泌的因子BMP6可能通过调节神经因子GDNF,在调节卵细胞成熟方面发挥其作用。2.BMP6通过上调人颗粒细胞中CTGF的表达水平促进CD68的表达BMP6是类固醇激素分泌的重要调节因子,可预防排卵前卵子过早黄素化,并且调节排卵后黄体的降解。结缔组织生长因子(CTGF)是一个多功能的调节因子,在调节哺乳动物黄体形成和卵泡功能方面起着重要的作用。CD68是巨噬细胞的标志物,文献报道,巨噬细胞在调节黄体代谢方面发挥重要作用。【实验目的】:探讨BMP6对CTGF和CD68表达的影响,以及潜在的机制。【实验方法】:研究以SVOG和h GC细胞为细胞模型。对重组人BMP6处理后CTGF和CD68的表达进行了检测。【结果】:我们的数据显示,在SVOG和h GC细胞中,BMP6显著上调了CTGF和CD68在细胞中的表达。利用BMP I型受体抑制剂(dorsomorphin,DMH-1和SB431542),证明ALK2和ALK3参与BMP6对CTGF的调节过程。此外,利用小干扰RNA技术特异性敲除内源性SMAD4,可以消除BMP6诱导的CTGF和CD68的上升,表明SMAD信号通路参与了BMP6诱导的CTGF的上升和CD68的表达。进一步研究表明,特异性敲除CTGF后,BMP6诱导的CD68表达的升高的作用消失。【结论】:在人颗粒细胞中,BMP6通过I型受体(ALK2和ALK3)和SMAD信号通路诱导CTGF表达的上调并以此介导CD68表达的增加。3.BMP6通过上调人颗粒细胞中Furin的合成促进TGF-b1的表达Furin是枯草杆菌型蛋白质前体转化酶家族中的一员,通过裂解分泌通路中的非活性蛋白前体,控制多种功能蛋白的活化。【实验目的】:探讨BMP6对furin表达的影响,及其对前体蛋白TGF-b1表达的影响以及潜在的机制。。【实验方法】:实验以SVOG和h GC细胞为细胞模型。对重组人BMP6处理后furin的表达和TGF-β1的生成和活化进行了研究。实验应用BMP I型受体抑制剂(dorsomorphin和DMH-1),小干扰RNA特异性作用于ALK2/3/6,SMAD4和furin用来研究其基本分子机制。【结果】:在SVOG和h GC细胞中,BMP6显著促进furin在细胞中的表达。利用BMP I型受体抑制剂(dorsomorphin,DMH-1和SB431542)和小干扰RNA技术,证明ALK2和ALK3参与BMP6对furin的调节过程。此外,利用小干扰RNA技术特异性敲除内源性SMAD4,可以消除BMP6诱导的furin表达的上升,表明SMAD信号通路参与了BMP6诱导的furin表达的上升。进一步研究表明,特异性敲除furin后,BMP6诱导的TGF-β1表达升高的作用消失。【结论】:在人颗粒细胞中,BMP6通过I型受体(ALK2和ALK3)和SMAD信号通路诱导furin表达的上升并以此介导TGF-β1表达的增加。