NK/T细胞淋巴瘤(Natural Killer T-Cell Lymphoma,NKTCL)是非霍奇金淋巴瘤中的一种亚型疾病,其特点是好发于鼻腔,并且其发病率较高。在临床上,患者的病情往往发展迅速,并且预后较差。从流行病学分析,该病常见于东亚及拉丁美洲地区,而罕见于欧美等发达国家。然而,该病的详细的发病原因尚不清楚,目前研究认为该病的发病与EB病毒感染和慢性鼻炎有关。另外,有研究提出遗传因素可能也发挥一定的作用。近年来,国内外学越来越关注对肿瘤多药耐药逆转的研究。由于该病的发病的原因的复杂性,对该病患者的治疗及预后都产生了极大的困难。在肿瘤早期阶段治疗中,化疗是较为传统和重要的治疗方法。然而,在肿瘤的化疗过程中极易产生多药耐药(Multidrug resistance,MDR)性。MDR往往是导致化疗失败的主要因素,这对肿瘤的化疗治疗极其的不利。因此,进一步深入的研究肿瘤产生耐药性的分子机制,将为探索耐药靶点,并针对靶点设计逆转肿瘤细胞多药耐药性的药物,提供重要的理论基础。过度分泌的白细胞介素-6(IL-6),在许多慢性炎症疾病中起着重要的作用。IL-6与IL-6R结合后主要激活3个信号通路:JAK/STAT,ERK1/2/MAPK和PI3-K信号通路。一些报告表明,IL-6R表达参与肿瘤的生长和转移,表明IL-6信号通路与肿瘤的生长和发展有关。IL-6介导的JAK1/STAT3或NF-κB通路在癌细胞的耐药性如肺癌细胞、卵巢癌细胞和前列腺癌细胞发挥重要作用。但是,由于IL-6调控网络的复杂性,IL-6与NK/T淋巴瘤的生长和发展的关系仍不清楚。IL-6和其介导的相关信号通路对NKTCL有何生物学特性影响及其分子机制尚不清楚,还有待于进一步的研究。本研究中,我们首先通过酶联免疫吸附测定(ELISA),检测IL-6在鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者以及慢性鼻炎患者外周血清中表达情况,并分析其与临床病理参数、疗效之间的关系,并检测了ABC超家族耐药相关蛋白(ABCG2、ABCC4、P-gp和MRP1)表达水平。体外研究,检测IL-6对于NK/T细胞淋巴瘤细胞的生长增殖、细胞周期、细胞凋亡及化疗药物敏感性等生物学特性的影响,同时Western blot法检测细胞中多药耐药基因的表达变化及IL-6介导的信号通路中相关关键蛋白的表达;我们最后通过动物实验体内研究,探索了IL-6对NK/T细胞淋巴瘤中ABC膜转运蛋白介导的多药耐药的影响。本研究旨在探索IL-6对NK/T细胞淋巴瘤中ABC膜转运蛋白介导的多药耐药的分子机制,这为寻找NK/T细胞淋巴瘤耐药逆转药物提供了实验及理论参考。本课题包括以下三部分:1.IL-6在NK/T细胞淋巴瘤组织中的表达及临床意义;2.外源IL-6对SNK-6细胞耐药性影响的分子机制研究;3.外源IL-6对动物体内NK/T细胞淋巴瘤耐药性的研究。第一部分:IL-6在NK/T细胞淋巴瘤组织中的表达及临床意义方法1.苏木精伊红染色(HE染色):观察并分析NKTCL患者肿瘤组织中肿瘤细胞形态和组织学特点。2.使用酶联免疫吸附测定(ELISA):按照试剂盒说明书,对鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者外周血清中IL-6表达情况进行检测。3.分析血清中IL-6表达变化与患者临床因素的关系。4.免疫组化:检测ABC超家族蛋白(ABCG2、ABCC4、P-gP和MRP1)在NKTCL患者肿瘤组织中的表达情况。结果1.HE染色结果显示,在NKTCL患者肿瘤组织中,细胞呈现出弥漫浸润性的生长,由明显组织坏死以及粘膜表面有溃疡现象,肿瘤组织中的细胞形态单一、大小为中等,细胞质染色为淡染到透亮,有细胞浸润并且破坏血管壁现象。2.ELISA检测结果显示,与对照组相比,鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者外周血清中IL-6含量显著下调(P<0.01)。3.IL-6的表达变化与NKTCL患者的年龄、性别、发生部位、临床分期及乳酸脱氢酶(LDH)的含量均无关,而Ki-67>80%的患者血清中IL-6的水平明显低于Ki-67<80%的患者,在NK/T细胞淋巴瘤患者外周血清中IL-6的表达下调率在有效组(94.4%)明显的高于无效组(42.9%)(P<0.05)。4.免疫组化检测鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者的肿瘤组织和正常组织中ABC超家族蛋白(ABCG2、ABCC4、P-gp和MRP1)表达水平情况,结果显示ABCG2、ABCC4和P-gp蛋白在NK/T细胞淋巴瘤患者组肿瘤组织标本中的表达水平明显高于对照组,而MRP1在本组织中灶阳性不明显。第二部分:外源IL-6对SNK-6细胞耐药性影响的分子机制研究方法1.采用小剂量反复诱导法构建SNK-6/ADM耐药细胞株,通过CCK-8法检测耐药细胞模型与野生株的耐药指数,筛选稳定的SNK-6/ADM耐药细胞株。2.CCK-8法检测IL-6对SNK-6/ADM耐药细胞模型与SNK-6野生株的耐药、生长与增殖的影响。3.流式细胞术检测IL-6对SNK-6/ADM耐药细胞模型与野生株的细胞周期和凋亡的影响。4.Western blot法检测ABC膜转运蛋白(ABCC4和P-gp)及IL-6介导的信号转导相关蛋白(p-JAK2、p-STAT3和NF-κB)表达情况。结果1.CCK-8检测并筛选耐药细胞株,结果显示耐药细胞株SNK-6/ADM的阿霉素IC50值为35.54μg/mL,耐药指数为:35.54/6.340=5.61,表明成功获得了SNK-6阿霉素耐药细胞株SNK-6/ADM。2.CCK-8检测发现,IL-6对SNK-6/ADM耐药细胞模型与SNK-6野生株的增殖无明显的影响,而显著抑制了耐药细胞SNK-6/ADM对阿霉素的耐药性。3.流式细胞术检测结果表明,IL-6联合阿霉素处理显著抑制SNK-6/ADM耐药细胞模型的细胞周期并促进细胞的凋亡。4.Western blot检测发现,与野生株SNK-6细胞相比,SNK-6/ADM耐药细胞中耐药相关蛋白ABCC4和P-gp蛋白表达量明显增加,在耐药细胞中,IL-6对P-gp表达影响不大,而显著抑制了ABCC4蛋白的表达。另外IL-6信号通路相关关键蛋白检测结果显示,与野生株SNK-6细胞相比,SNK-6/ADM耐药细胞中p-JAK2、p-STAT3和NF-κB蛋白表达变化不大,而外源添加IL-6后,SNK-6/ADM耐药细胞中p-JAK2、p-STAT3和NF-κB蛋白表达显著下调。第三部分:外源IL-6对动物体内NK/T细胞淋巴瘤耐药性的研究方法1.采用SNK-6/ADM耐药细胞株通过左侧乳头皮下注入构建耐药实体型NK/T细胞淋巴瘤肿瘤耐药动物模型。2.给荷瘤SNK-6/ADM小鼠体内IL-6或阿霉素药物干预后,检测小鼠肿瘤生长及小鼠的存活率情况。3.免疫组化法检测小鼠肿瘤组织中ABC膜转运蛋白(ABCC4和P-gp)表达情况。结果1.荷瘤小鼠进行体内药物干预后,对其肿瘤重量和体积检测发现,SNK-6/ADM小鼠经IL-6联合阿霉素治疗后,抑制肿瘤生长效果明显增加,并且耐药小鼠的生存率显著增加。2.荷瘤小鼠进行体内药物干预后,发现与对照相比,IL-6联合阿霉素处理SNK-6/ADM小鼠肿瘤组织中ABCC4表达明显减少。结论1.IL-6在NK/T细胞淋巴瘤患者外周血清中表达下调,其下调率与Ki-67指数和疗效呈负相关,而肿瘤组织中ABC膜转运蛋白表达显著增加,提示IL-6与NK/T细胞淋巴瘤多药耐药有密切关系2.外源IL-6联合ADM可抑制SNK-6/ADM周期进程并促进其凋亡,同时下调了p-JAK2、p-STAT3和NF-κB和ABCC4的表达,从而逆转了NK/T细胞淋巴细胞的耐药性。3.动物体内实验进一步证实,IL-6联合ADM抑制了SNK-6/ADM小鼠肿瘤的生长,显著提高小鼠的生存率,ABCC4的表达显著下降,推测IL-6可逆转肿瘤耐药性。因此,IL-6可以作为体内逆转肿瘤耐药的一个潜在的靶标。