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海绵属于底栖滤食动物,其独特的滤食系统使其体内蕴藏了丰富的微生物,这些微生物不仅对海绵的生存具有重要意义,也是人类有待开发的重要海洋微生物资源。我国南海海域辽阔,海绵多样性与生物量极其丰富。为从海绵微生物中挖掘新的细菌菌种,本文对培养时间、培养基种类、培养基中添加海绵提取物、调整培养基中无机氮、磷源以及采用二次分离法对海绵细菌可培养性的影响进行了研究,并对获得的两株菌进行了多相分类,结果如下:
在平板培养实验过程中,发现培养第一周平板表面菌落数、菌落种类数形成较快,之后菌落数、菌落种类数增加缓慢,但仍有新的菌落形成.
培养基成分对海绵细菌的分离培养有较大影响。在2216E和R2A两种培养基中,R2A培养基上获得的菌落数和菌落种类数均最多。以R2A作为基础培养基,添加海绵提取物、无机氮源和无机磷源均有利于海绵样品中细菌的分离培养。
本论文还首次建立了二次分离法。二次分离法的基本思想是:首先通过常用的细菌培养基把样品中部分细菌分离出来,然后将在常用细菌培养基上难以形成菌落的细菌转至另一培养基进行分离培养。该方法使用2216E培养基作为第一次分离的培养基,使用SPA培养基作为第二次分离的培养基,通过此方法从海绵中分离到18株细菌。
将分离到的菌株进行16S rDNA测序分析,其中,菌株HB09009与Bacilluscarboniphilus同源性最高,仅为97.1％;菌株HB09011与Coxiella burnetii同源性最高,仅为95.4％;菌株HB09012与Planctomyces maria同源性最高,为97.4％。三株菌在Genbank的登录号分别为GU263833、GU319886和GU263834。对其中2株细菌进行多相分类鉴定。菌株HB09009具有芽孢杆菌属的典型特征,与系统发育树上亲缘关系最近的B.carboniphilus相比,二者在生长条件、培养特征和生理生化等方面存在较大的差异,可能是Bacillus属的一个新种,暂定名为Bacillus sp.HB09009。菌株HB09012具有浮霉菌属的典型特征,与系统发育树上亲缘关系最近的P.maris相比,二者在生长条件、培养特征和生理生化特性等方面也存在较大的差异,可能是Planctomyces属的一个新种,暂定名Planctomyces sp.HB09012。