植物在生长发育的过程中,不可避免的会遇到各种各样的不利环境,特别是高温、低温、高盐、干旱、氧化损伤等非生物胁迫,它们严重的影响了植物的生长发育及产量,因此研究植物胁迫响应基因具有十分重要的意义。为了适应环境变化,植物自身形成了一套复杂的机制来适应环境的变化。这种机制离不开胁迫信号的识别、转导、传递及相应基因的表达。蛋白激酶是生物内普遍存在的一种响应外界变化的调节激酶,在信号转导、传递中发挥重要的作用。目前研究的参与植物生物胁迫和非生物胁迫的蛋白激酶主要有五类:受体蛋白激酶(receptor-like kinase,RLK)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK,MPK)、钙依赖而钙调素不依赖蛋白激酶(calcium-dependent and calmodulin-independent protein kinase,CDPK)、蔗糖不发酵相关蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase,Sn RK)及其它胁迫相关的植物蛋白激酶。MAPK基因作为MAPK级联途径中最下游的蛋白激酶,可通过逐级磷酸化作用,将细胞外的信息级联放大,调控下游基因的表达,与其他基因一起形成庞大的网络,调节生物体内各种生理反应,响应外界环境。目前为止,MAPK基因家族已经在拟南芥、烟草、水稻、玉米、二穗短柄草、棉花、番茄、葡萄、杨树、香蕉和苹果等多种植物中被鉴定。MAPK虽然在多种植物中被鉴定,但其在逆境胁迫中的功能特性及作用机制的研究多集中在草本植物中,在木本植物中还很少。桑树是一种多年生的木本植物,具有耐旱、耐盐碱、耐涝、耐寒、抗逆性强和生长迅速的特性,而桑树抗逆性方面的研究极少。我们以前的研究已从桑树中鉴定了32个Mn MAPKKK,5个Mn MAPKK和10个Mn MAPK。q RT-PCR分析10个桑树MAPK基因在不同胁迫处理下表达情况发现,不同的桑树MAPK在相同的胁迫处理下表达量有所不同,同一桑树MAPK在不同的胁迫处理下表达情况也有所差异,表明桑树MAPK在不同的胁迫处理中可能发挥不同的作用。同时,桑树MAPK5在桑树不同胁迫处理后发现,桑树MAPK5表达量在Na Cl,高温和低温处理后上调,但仅在高温和低温胁迫下存在显著性差异,在脱落酸(abscisic acid,ABA),水杨酸(salicylic acid,SA)和H2O2处理后其表达量显著降低,在干旱和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)处理后其表达量稍稍降低。桑树MAPK5表达量在不同的胁迫中都表现表达模式不同,暗示桑树MAPK5在逆境胁迫中可能发挥着重要的作用。因而我们选择桑树MAPK5进行功能研究,以期阐明该基因的功能,丰富我们对桑树MAPK基因在桑树胁迫功能的理解。本研究基于已报道的桑树MAPK信息,完成了Mn MAPK5的生物信息学分析,表达谱分析,上游启动子序列分析和亚细胞定位等。通过构建Mn MAPK5过表达载体,以农杆菌为介导转入到拟南芥中,成功获得5个Mn MAPK5过表达转基因拟南芥株系,并对其进行高盐、干旱、低温、高温、氧化等胁迫处理及ABA、SA和Me JA等激素诱导,通过测定种子萌发率,萌发后根长,营养生长阶段胁迫后的生长状况等方法确认其在不同胁迫处理下影响。此外又通过测定H2O2含量,脯氨酸含量,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,可溶性糖含量,抗氧化酶活性,胁迫相关基因的表达等指标来探究Mn MAPK5在胁迫响应中的机理。研究结果如下:1.Mn MAPK5基因的生物信息学分析及其启动子分析基于之前的研究,对B族的MAPK基因进行了进化分析,多序列比对分析。多系列比对结果发现,Mn MAPK5蛋白与其他物种B族MAPK蛋白结构保守性很高,含11个保守结构域,在第VII和第VIII结构域之间有TEY的双磷酸化位点,存在P-loop、A-loop、C-loop及docking domain等保守位点。B族MAPK系统进化分析表明,Mn MAPK5与苹果,棉花的B族MAPK聚在一起,且与Md MPK13-2、Gr MPK12、Sl MPK4、Nt MPK4的相似性很高,达到83%以上。而与Mn MAPK5相似性较高的Nt MPK4、At MPK4、Zm SIMK1和At MPK13能够被多种胁迫所诱导,暗示Mn MAPK5可能和它们有相似的功能。Plant CARE在线预测软件预测Mn MAPK5启动子序列中含多种与植物胁迫响应、激素信号和生长发育相关的顺式作用元件,暗示Mn MAPK5可能参与多种胁迫及信号路径。用Mn MAPK5启动子驱动GUS基因,构建Pro Mn MAPK5-GUS载体并转化到拟南芥中,成功获得3株转基因拟南芥。Mn MAPK5启动子实验中发现,转基因拟南芥在受到高盐、高温、低温和干旱胁迫时,GUS信号表现出先增加后降低的趋势,说明Mn MAPK5启动子能够参与这些胁迫响应。观察Mn MAPK5启动子驱动的GUS基因在拟南芥不同时期表达发现,GUS信号在幼苗萌发后3天就可以被清晰的观察到,随着植物的生长,GUS信号越来越强,Mn MAPK5启动子驱动的GUS基因在拟南芥的根、茎、叶、花萼、花丝、花药、柱头及长荚果中都有表达,暗示,桑树Mn MAPK5启动子是一个组成型启动子。2.Mn MAPK5的亚细胞定位及表达谱分析亚细胞定位预测软件预测发现,Mn MAPK5在细胞核和细胞质中都有分布,核定位信号预测软件预测发现Mn MAPK5的核定位信号很弱。为确认Mn MAPK5蛋白在细胞中的分布,我们构建35S-Mn MAPK5:EGFP和35S-EGFP过表达载体,瞬时转化到洋葱表皮细胞中。结果发现,与EGFP在细胞中的分布一致,35S-Mn MAPK5:EGFP的融合蛋白在细胞的细胞核和细胞质中都有分布,说明Mn MAPK5在细胞质和细胞核处都有分布,暗示Mn MAPK5可能在细胞质和细胞核中都发挥作用。为确认Mn MAPK5在桑树中的表达情况,定量检测发现Mn MAPK5在川桑的根、茎、叶、皮、花、果各个组织都有表达,不同的组织中它们的表达量不同,在茎和果中的表达量最高,在花中的表达量最低,暗示Mn MAPK5是一个组成型表达的基因。桑树胁迫诱导表达分析发现,40℃处理的叶中和30%PEG处理后的茎中,桑树MAPK5基因的表达量显著性上调;在40℃处理的根中,4℃处理后的根、茎、叶中,30%PEG处理后的叶中,ABA处理后的茎中及Me JA处理后的叶中,桑树MAPK5基因的表达呈先增加后降低的趋势;在30%PEG处理后的根中,Na Cl处理的根和茎中,H2O2处理的茎中及SA处理后的根茎叶中,桑树MAPK5基因的表达显著受到抑制;在ABA处理后的根叶中,H2O2处理的根叶中及Me JA处理后的茎中,桑树MAPK5基因的表达则呈先降低后增加的趋势;而在Na Cl和H2O2处理的叶中及Me JA处理后的根中,桑树MAPK5基因的表达模式更为复杂。由此可见,桑树MAPK5基因的表达响应模式在不同胁迫中差异显著,暗示,桑树MAPK5可能在不同胁迫中有不同的功能。3.Mn MAPK5转基因拟南芥在不同胁迫下的功能研究通过浸花法转化拟南芥,获得了5株Mn MAPK5阳性的转基因拟南芥,选择Mn MAPK5表达量高(OE3),中(OE5),低(OE1)的转基因拟南芥作后续材料来进一步研究该基因在不同胁迫下的功能。在盐胁迫条件下,OE拟南芥显著的比WT的萌发率低,根长短,长势差。由此可见,Mn MAPK5在转基因拟南芥中降低了对盐胁迫的抗性。此外,测定300m M Na Cl胁迫后的一些生理指标和胁迫相关基因发现,OE拟南芥中的MDA含量显著的比WT的高,而可溶性糖的含量,CAT表达量及酶活性和RD22表达量都比WT低。表明Mn MAPK5在盐胁迫条件下一方面通过降低细胞内CAT的表达量及酶活和可溶性糖含量,使细胞内产生过量的H2O2,质膜发生膜脂过氧化物作用,破坏细胞膜的结构;另一方面通过降低胁迫相关基因,如RD22基因来降低对盐胁迫的抗性,暗示Mn MAPK5可能在Na Cl胁迫响应中起到了负调控的作用。干旱胁迫条件下,OE拟南芥的萌发率,根长比WT的要低,植株萎蔫、干枯死亡的现象比WT严重,由此可见,Mn MAPK5过表达的转基因拟南芥提高了对干旱胁迫的敏感性。此外,干旱胁迫后OE拟南芥中的H2O2、MDA含量显著的比WT要高,而脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活力及表达量、CAT活力及表达量和MYB44表达量都比WT低。综上所述,在干旱胁迫条件下,Mn MAPK5过表达的转基因拟南芥中的POD、CAT的表达量和活力都降低,产生大量H2O2,诱发细胞发生膜脂过氧化物作用,破坏细胞膜的结构,而细胞内的渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖含量不能弥补干旱胁迫对其造成的伤害;另一方面,干旱胁迫下,Mn MAPK5还降低了MYB44基因的表达,从而降低了其对干旱胁迫的抗性。冷胁迫条件下,OE拟南芥萌发率稍比WT的低,叶绿素含量显著的比WT低,OE拟南芥出现萎蔫,干枯死亡的现象比WT严重,由此可见Mn MAPK5过表达的转基因拟南芥提高了冷胁迫敏感性。此外,冷胁迫条件下OE拟南芥脯氨酸含量,可溶性糖含量,POD活力及表达量,CAT活力及表达量,ABF4,RAB18,RD29A和RD22基因表达量都比WT中的低。以上结果表明,Mn MAPK5过表达的转基因拟南芥在冷胁迫条件下,并不能通过增加渗透调节物质脯氨酸,可溶性糖含量,POD和CAT含量及酶活和胁迫相关基因的表达来提高对低温的抗性。在35℃条件下,WT种子的萌发率显著的比是OE拟南芥高,但是其根长却没有显著的差异,暗示了Mn MAPK5在高温条件下可能对植物的萌发有影响更大。氧化胁迫下,OE拟南芥的萌发率、长势都不如WT,说明Mn MAPK5在拟南芥中降低了对氧化胁迫的抗性。此外,OE拟南芥的MDA含量显著的比WT高,而脯氨酸含量,可溶性糖含量,POD、CAT和ABF4表达量比WT低,暗示Mn MAPK5过表达的转基因拟南芥提高对氧化胁迫的敏感性很可能是Mn MAPK5过表达的转基因拟南芥在氧化胁迫条件下,H2O2积累,Mn MAPK5基因调控的抗氧化酶的表达量降低,破坏了细胞膜结构,而细胞本身并不能通过增加渗透调节物质脯氨酸,可溶性糖来抵抗氧化胁迫并通过过氧化作用破坏细胞结构降低对氧化胁迫的抗性。在研究激素诱导下对Mn MAPK5转基因拟南芥的影响发现,ABA诱导下,Mn MAPK5过表达的转基因拟南芥的种子萌发率及根长都降低;Me JA诱导下,营养生长阶段OE拟南芥的长势要比WT拟南芥长势好;SA诱导下,拟南芥种子萌发后5d时,WT种子萌发比OE拟南芥萌发率稍高,且幼苗萌发后WT黄化现象比OE拟南芥严重,暗示Mn MAPK5可能与ABA、SA、Me JA信号转导过程有关。综上所述,Mn MAPK5与其他物种B族MAPK一样,其蛋白结构保守性很强,都含有11个保守结构域,在第VII和第VIII结构域之间有TEY的双磷酸化位点,含P-loop、A-loop、C-loop及docking domain;Mn MAPK5与Md MPK13-2、Gr MPK12、Sl MPK4、Nt MPK4的相似性很高,达到83%以上。Mn MAPK5启动子序列中含有与胁迫相关的,植物激素相关的及植物生长发育相关的顺式作用元件,暗示Mn MAPK5可能参与多种胁迫和信号路径。含Mn MAPK5启动子驱动的GUS基因的转基因拟南芥能够在不同的时间点响应高盐、高温、低温、干旱胁迫,说明Mn MAPK5启动子能够参与这些胁迫响应。亚细胞定位实验发现,Mn MAPK5在细胞质和细胞核中都有定位,暗示可能在细胞质和细胞核中都有作用。表达谱分析发现Mn MAPK5在川桑的根、茎、叶、皮、花、果各个组织都有表达,在不同的组织中它们的表达量不同,在茎和果中的表达量最高,在花中的表达量最低;在受到不同的胁迫时,其表达模式差异较大,这可能与它在不同胁迫中所起的作用不同有关。而Mn MAPK5转基因拟南芥在不同胁迫处理后发现,Mn MAPK5转基因拟南芥可能主要是通过降低抗氧化酶的活性和表达量及相应的胁迫相关基因的表达,增加ROS的积累,降低了对Na Cl、PEG、低温、高温、H2O2胁迫的抗性。