研究背景:越来越多的研究表明,miRNAs是多种肿瘤重要的转录后调节因子,在肿瘤的发生、发展以及转移过程中起着重要的作用。据报道,miR-543通过促进前列腺癌的生长在前列腺癌中扮演着促癌基因的角色,然而miR-543调控前列腺癌细胞的增殖、转移和干性特性的研究以及其具体机制尚未被阐述。研究目的:探讨miR-543促进前列腺癌细胞增殖、转移以及干性特征的相关分子机制,从而探讨前列腺癌复发转移的相关分子生物学机制,期待为前列腺癌新的治疗手段提供坚实的理论基础。研究方法:本实验采用荧光定量PCR检测前列腺癌CD44~+PC3、CD44~-PC3、CD44~+Du145、CD44~-Du145细胞中miR-543的表达水平。分别向DU145和PC3细胞系转染miR-543的模拟剂、抑制剂后,采用荧光定量PCR检测miR-543、Numb以及干细胞相关的标记分子的表达情况;Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;克隆形成实验检测细胞的增殖能力;利用干细胞悬浮成球和3-D matrigel成球实验技术检测前列腺癌干细胞相关特性;以及利用Western Blot检测干细胞相关蛋白的表达。在CD44~+前列腺癌细胞中过表达Numb或者在CD44~-前列腺癌细胞中敲低Numb后,采用平板克隆、悬浮成球、Transwell技术分别检测细胞的增殖、自我更新、迁移以及侵袭能力。生物信息学和双萤光素酶报告实验分别用来预测和验证Numb是否为miR-543的靶基因。同时,我们还构建含全部Numb cDNA序列但不含有Numb 3’UTR全部序列的过表达质粒,在PC3细胞中共转染Numb和miR-543。将转染miR-543后的PC3细胞系接种于免疫缺陷性小鼠皮下和尾静脉,观察小鼠皮下成瘤能力和尾静脉肺转移的情况。研究结果:CD44~+PC3和CD44~+Du145细胞miR543表达水平分别高于CD44~-PC3和CD44~-Du145细胞。前列腺癌细胞内转染模拟剂后miR-543表达明显高于对照组,而Numb的表达水平均低于对照组,miR-543过表达组细胞的侵袭、克隆形成、干细胞悬浮成球以及细胞贴壁非依耐性生长的能力高于对照组。转染抑制剂的前列腺癌细胞miR-543表达水平明显低于对照组,Numb的表达水平高于对照组,并且细胞侵袭能力、克隆形成能力、干细胞悬浮成球以及细胞贴壁非依耐性生长的能力明显下降。Western Blot结果显示miR-543过表达则Numb表达下调,miRNA敲低则Numb过表达,两者表达情况刚好相反。在CD44~-PC3细胞内敲低Numb后,细胞的侵袭能力、贴壁非依赖性生长以及干细胞悬浮成球能力均增加,在CD44~+PC3细胞中过表达Numb后,则出现相反的结果。双荧光素酶基因报告实验结果显示miR-543可抑制野生型Numb 3’UTR报告基因载体的荧光素酶活性,而对突变型Numb 3’UTR的荧光素酶活性无影响,该结果与我们软件预测miR-543的靶基因的结果一致。PC3细胞共转染不含3’UTR的Numb过表达质粒和miR-543 mimic后,实验结果显示Numb过表达能够逆转miR-543的促癌作用。miR-543过表达后小鼠皮下成瘤体积明显增大,miR-543敲低则抑制小鼠皮下成瘤的大小。miR-543过表达后小鼠的肺转移能力也增强。研究结论:miR-543通过直接抑制Numb基因,正向的调控前列腺癌细胞增殖、转移以及干性特性,从而促进肿瘤的发生和转移,miR-543有望成为治疗前列腺癌转移的潜在靶点。