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目的明确miR-520d/Beclin-1信号轴与三阴性乳腺癌细胞自噬和耐药间的关系;阐明复方斑蝥注射液如何通过miR-520d/Beclin-1信号轴逆转化疗耐药,为耐药性三阴性乳腺癌患者的临床治疗提供实验依据和用药参考。方法1.miR-520d/Beclin-1信号轴对三阴性乳腺癌细胞自噬和耐药的影响:构建三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468的耐药株MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc,并用MTT法和流式凋亡实验验证耐药模型。采用多西他赛作用于三阴性乳腺癌细胞的亲本株和耐药株,给予Con组（模型组）,Beclin-1 OE（Beclin-1稳转系组）组,miR-520d mimics组（过表达miR-520d组）,Beclin-1 OE+miR-520d mimics组（联合用药组）干预,与对照组比较观察多西他赛作用下各组细胞的自噬及凋亡情况。RT-PCR检测miR-520d在亲本株及耐药株中的表达水平;MTT、流式凋亡实验检测miR-520d作用下肿瘤细胞对多西他赛敏感性;MDC、Western blot、免疫荧光检测细胞自噬水平以及自噬相关蛋白的改变;通过荧光素酶报告基因检测miR-520与Beclin-1 3’UTR序列的结合,并明确miR-520d对Beclin-1的直接调控作用。2.复方斑蝥注射液逆转三阴性乳腺癌化疗耐药的可能机制:设立Con组（对照组）、Doc组（多西他赛组）、CCI组（复方斑蝥注射液组）、CCI+Doc组（多西他赛联合复方斑蝥组）以及Con组（模型组）,CCI组（复方斑蝥组）,CCI+miR-520d inhibitor（复方斑蝥联合miR-520d抑制剂组）组。MTT、流式凋亡实验和Tunel检测各用药组对乳腺癌耐药株增殖及凋亡的影响;MDC、Western blot、免疫荧光检测耐药株自噬水平以及自噬相关蛋白的改变;miRNA芯片检测复方斑蝥注射液处理前后的三阴性乳腺癌耐药株;MTT、MDC、免疫荧光检测复方斑蝥注射液对miR-520d表达作用的关系。3.动物模型验证:建立三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231/Doc耐药动物模型,设立多西他赛组（Doc组）、复方斑蝥注射液组（CCI组）、多西他赛联合复方斑蝥组（CCI+Doc组）,并与对照组（Con组）比较,研究各用药组对于肿瘤增殖的影响;Western blot检测肿瘤自噬水平的改变;RT-PCR检测肿瘤中miR-520d、Beclin-1的表达。结果:1.miR-520d/Beclin-1信号轴与三阴性乳腺癌细胞自噬和耐药的关系:在不同浓度的多西他赛作用下,耐药株MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-468/Doc的凋亡率均低于亲本株MDA-MB-231和MDA-MB-468,耐药株构建成功（P＜0.001）。miR-520d在耐药株中低表达,过表达miR-520d后耐药株存活率下降（P＜0.001）;与亲本株相比,耐药株中自噬相关蛋白的表达增加（P＜0.001）。用药后与Control组相比,Beclin-1 OE组中耐药株的存活力升高;当同时上调Beclin-1和miR-520d时,耐药株的存活率较Beclin-1 OE组降低（P＜0.001）。同时,过表达miR-520d不仅可以使耐药细胞自噬活性明显降低,还可以降低在Beclin-1稳转系中人为升高的自噬水平。本部分实验证明了Beclin-1是miR-520d的可能靶分子。2.复方斑蝥逆转三阴性乳腺癌化疗耐药的可能机制:与Con组相比,各用药组Doc,CCI以及CCI+Doc可以抑制三阴性乳腺癌耐药细胞增殖,促进凋亡;而与单独用药组（Doc组,CCI组）相比,联合用药组（CCI+Doc组）对肿瘤的促凋亡作用更强（P＜0.001）。此外,与Con组相比,各用药组miR-520d表达水平上升,自噬水平下降,联合用药组中miR-520d表达最高,自噬水平最低（P＜0.001）。miRNA芯片检测耐药株MDA-MB-231/Doc发现,复方斑蝥注射液能够明显上调miR-520d表达水平;抑制miR-520d的水平能够明显减弱复方斑蝥所促进的三阴性乳腺癌耐药株对于多西他赛的敏感性。MDC和免疫荧光检测发现,与Con组相比,CCI组的自噬水平下降,而CCI+inhibitor组的自噬水平增高（P＜0.0001）。3.动物模型验证:与Con相比,各用药组肿瘤凋亡相关因子活性蛋白水平Caspase3、Cleaved Caspase3、Bax上调,肿瘤自噬蛋白LC3和Beclin-1下降;在联合用药组中,这种效果更为明显（P＜0.01）;在体内实验中,与单独用药组相比,Doc和CCI的联合用药上调miR-520d表达,抑制Beclin-1水平（P＜0.01）。结论:1.通过调控miR-520d水平可能改变自噬蛋白Beclin-1表达,从而逆转三阴性乳腺癌细胞对多西他赛的化疗耐药性;2.复方斑蝥注射液通过上调miR-520d的表达,抑制三阴性乳腺癌自噬水平,从而逆转化疗耐药;3.复方斑蝥注射液通过调控三阴性乳腺癌动物耐药模型的miR-520d/Beclin-1信号轴逆转三阴性乳腺癌化疗耐药。