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白细胞介素1(Interleukin 1,IL-1)是参与炎症和免疫反应的内源性细胞因子家族之一,在宿主对抗胞内微生物(如李斯特菌或布鲁氏杆菌)中起着重要作用。其中,白介素1α(IL-1α)、白介素1β(IL-1β)和由IL-1RN编码的白介素1受体拮抗因子(IL-1Ra)是IL-1家族的重要成员。因此,研究IL-1β与IL-1Ra之间的平衡关系对维持机体的稳态以及控制相关疾病发生发展提供了一个新的思路。布鲁氏菌病(简称“布病”)是由布鲁氏菌引起的人兽共患病,严重危害人与动物的健康。动物布病疫苗的使用有助于布病预防。但使用疫苗后,现有的免疫学检测方法无法区分布病自然感染动物和疫苗免疫动物,导致无法有效扑杀布病患病动物,严重阻碍了布病的净化与防控。本课题组前期工作通过构建布鲁氏菌强毒、弱毒株感染绵羊白细胞层抑制性消减杂交(SSH)cDNA文库,筛选到差异表达基因白介素1β(IL-1β)和白介素1受体拮抗因子(IL-1Ra),并证明布鲁氏菌疫苗株与野毒株感染可引起这两个基因存在明显的差异表达现象。因此,本研究建立了IL-1β及其拮抗因子的双荧光ELISA检测方法,并初步探讨其区分布病自然感染与疫苗免疫的鉴别诊断作用,以期为有效区别鉴定布病免疫动物与患病动物研发一种新的指示性检测方法,同时为检测其它相关疾病中IL-1β与IL-1Ra的浓度提供了一个快捷、精准、可应用的检测方法。本研究为了扩大所建方法的物种检测范围,选取了多个物种的IL-1β与IL-1Ra的蛋白序列,在IL-1β与IL-1Ra非同源区段分别选出两段各物种间蛋白保守区序列,用于制备捕获抗体和检测抗体,并验证分析这两种抗体的效价及与多物种蛋白样品的杂交反应特性,建立双抗夹心双荧光ELISA检测方法。通过条件优化,最终得到IL-1β与IL-1Ra的标准曲线方程分别为y=0.0076x-0.0058和y=0.0027x+0.0251,相关系数R~2分别为0.99371和0.9904,检测线性范围均在76 pg/mL-625 ng/mL,两者的最低检测限均为11 pg/mL,IL-1β的平均回收率为92.52%,IL-1Ra的平均回收率为89.70%,重复性及特异性均良好。利用所建立的双抗夹心双荧光ELISA检测方法检测临床实际样本中IL-1β及IL-1Ra的浓度值,所检样品包括布病疫苗免疫羊血样、未免疫布病疫苗健康羊血样、布菌患病羊血样共1005份,计算IL-1Ra/IL-1β比值,统计学分析各组数据的差异显著性以及ROC曲线的诊断学意义。数据分析显示,三类羊血样间IL-1Ra/IL-1β均有显著性差异;ROC分析证实,IL-1Ra/IL-1β无法区分布病疫苗免疫羊与健康未免疫羊,但在区分布病自然感染羊与疫苗免疫羊鉴别诊断方面有一定的参考价值。此外,该方法还初步应用于检测小鼠和人样品中IL-1β与IL-1Ra,结果显示在炎症性肠病(IBD)造模小鼠中,发病前后小鼠血清中IL-1β与IL-1Ra浓度值与阴性正常组相比升高。通过检测健康人血清样品,分析获得健康人血清中IL-1β与IL-1Ra含量及其比值的分布范围。综上所述,本研究建立的IL-1β与IL-1Ra及其IL-1Ra/IL-1β比值双荧光同步ELISA方法,可以检测羊、人、小鼠血样中IL-1β与IL-1Ra,根据捕获抗体和检测抗体与多物种蛋白杂交反应特性,理论上可以检测绵羊、人、牛、马、猪、鼠、兔等多个物种中IL-1β与IL-1Ra的含量,具有更广泛的检测物种应用范围。此外,该方法测定的IL-1Ra/IL-1β比值在鉴别诊断布病患病羊与布病疫苗免疫羊方面具有的一定的指示意义,可联合虎红平板凝集试验为区别布鲁氏菌病自然感染与疫苗免疫的鉴别诊断及布病防疫净化提供参考。