目的:包装已成功构建的受HSV-I晚期表达基因-UL38启动子调控的、嗜肿瘤单纯疱疹病毒介导的GALV.fus基因质粒(HSV-UL38P- GALV.fus),无肿瘤特异性巨细胞病毒启动子(CMVP)GALV.fus质粒(HSV-CMVP- GALV.fus),GALV.fus基因片段被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因片段所取代的治疗对照质粒(HSV-CMVP-EGFP),分别命名为Synco-2、Synco-1、Baco-1。方法:扩增已成功构建的HSV-UL38P- GALV.fus、HSV-CMVP- GALV.fus、HSV-CMVP-EGFP质粒,然后分别在Vero细胞用脂质体转染、包装成重组嗜肿瘤单纯疱疹病毒。重组单纯疱疹病毒的扩增及纯化采用Vero细胞及氯化铯纯化常规方法,病毒滴度测定采用TCID50法。Synco-1、Synco-2病毒感染肝癌细胞株HepG2,分别提取受染肝癌细胞HepG2的总RNA,以RT-PCR的方法鉴定GALV.fus基因的表达。结果:成功包装了3种重组单纯疱疹病毒Baco-1、Synco-1和Synco-2,按需要在Vero细胞内扩增后以氯化铯密度梯度离心法进行纯化,TCID50法测得病毒滴度分别为3×1010pfu/ml,1×1011pfu/ml和4×1010pfu/ml。受染肝癌细胞株HepG2中以RT-PCR法检测到GALV.fus基因的表达。第二部分UL38和CMV启动子调控嗜肿瘤单纯疱疹病毒介导的GALV.fus基因系统治疗肺癌的体外试验研究目的:探讨HSV-I晚期表达基因-UL38启动子及无肿瘤特异性巨细胞病毒启动子调控的嗜肿瘤单纯疱疹病毒介导GALV.fus基因系统体外对人肺腺癌的选择性杀伤效应。方法:(1)细胞培养:肺腺癌细胞A549培养取含10%新鲜胎牛血清的RPMI1640培养基;正常人胚胎成纤维细胞(HFL-I GNHu5)取DMEM培养基。置5% CO2孵箱中,饱和湿度及37℃培养。(2)重组嗜肿瘤HSV-I病毒对肺癌细胞的致融性鉴定将生长良好的A549细胞以1×105个/孔接种于6孔板,将0.01 pfu重组嗜肿瘤HSV-I病毒(Baco-1、Synco-1和、Synco-2)加入各孔,空白对照组以PBS替代。感染24h后,在倒置显微镜下观察及照相。(3)重组嗜肿瘤HSV-I病毒感染肺癌细胞的杀伤效率测定:将生长良好的A549细胞以3×104个/孔接种于24孔板,将0.01 pfu重组单纯疱疹病毒(Baco-1、Synco-1和Synco-2)加入各孔。感染24h及48h后,收集细胞,用trypan blue染色后,倒置荧光显微镜下观察,镜下计数活细胞数。(4)不同MOI的重组嗜肿瘤HSV-I病毒对A549细胞的杀伤作用: 24孔板接种细胞株A549,分别加入不同MOI的单纯疱疹病毒进行转染(MOI=0.01、0.1、1),空白对照组以PBS替代。5%CO2孵箱37℃培养48h后,收集细胞,用trypan blue染色后,倒置显微镜下观察,计数活细胞数。(5)重组嗜肿瘤HSV-I病毒对体外细胞的特异性鉴定试验选用人胚胎成纤维细胞(HFL-I GNHu 5)作为试验对象,采用0.01pfu重组嗜肿瘤单纯疱疹病毒Synco-1和Synco-2感染。感染后,采用三种方法维持细胞生长:⑴10%胎牛血清DMEM维持,使细胞处于旺盛生长状态;⑵无血清DMEM维持,使细胞处于分裂静止状态;⑶无血清DMEM联合细胞分裂抑制药物洛伐他汀(Lovastatin),使细胞处于完全分裂抑制状态。24和48小时观察不同病毒对正常细胞的影响。(6)重组单纯疱疹病毒受染细胞GALV.fus基因的检测:分别提取已感染肺癌细胞A549和正常人胚胎成纤维细胞(HFL-I GNHu5)的总蛋白,以Western Blot法鉴定GALV.fus基因的表达。结果:⑴对肺癌细胞的致融性鉴定:倒置显微镜下观察显示,加入重组嗜肿瘤HSV-I病毒24h后,含GALV.fus基因的致融性病毒嗜肿瘤在肺癌细胞内引起强烈的细胞膜融合,数十至数百细胞融合形成巨大细胞融合斑。而非致融病毒Baco-1仅引起病毒细胞毒性效应,细胞呈圆形,镜下未见细胞融合斑。⑵重组HSV-I病毒感染肺癌细胞的杀伤效率测定:致融病毒载体Synco-1, Synco-2杀伤肺癌细胞的能力(70-90%)明显优于非致融病毒载体Baco-1,两者比较,差异明显。⑶不同MOI的重组HSV-I对A549细胞的杀伤作用:以不同MOI的重组HSV-I感染A549细胞,随重组单纯疱疹病毒MOI的增加,A549细胞的存活率明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),表明致融性重组HSV-I对A549细胞的杀伤作用随着感染复数的增加而逐渐增强。⑷重组HSV-I病毒对体外细胞的特异性鉴定试验:选用非特异性的CMVP调控的重组单纯疱疹病毒Synco-1在细胞生长静止抑制状态均引起细胞膜融合,与Synco-1显著不同的是,受UL38p调控的重组单纯疱疹病毒Synco-2仅在细胞生长状态导致细胞膜融合;而细胞处于静止和抑制状态时,不引起细胞膜融合以及任何细胞病理改变。⑸重组单纯疱疹病毒受染细胞GALV.fus基因的检测:A549细胞和正常人胚胎成纤维细胞(HFL-I GNHu5)感染Synco-1, Synco-2后均可检测到GALV.fus基因蛋白的表达。第三部分嗜肿瘤单纯疱疹病毒载体介导的GALV.fus基因系统治疗肺腺癌的体内试验研究目的:探讨重组嗜肿瘤单纯疱疹病毒介导的GALV.fus基因系统在体内对人肺癌的杀伤效应及建立人肺腺癌皮下瘤裸鼠模型的最佳方案。方法:⑴裸鼠肺癌模型建立方案的研究:①模型建立方案:选用4-6周裸鼠20只,以三种不同细胞剂量(1X106个/只、1X107个/只及1X109个/只)的细胞悬液及组织块接种法(1cmx1cmx2cm)对裸鼠右侧背腹部皮下进行皮下接种,观察成瘤情况,测量肿瘤的最大直径(a)和最大横径(b),计算肿瘤的体积(V=1/2ab2 ),比较成瘤效果。②裸鼠肺癌模型病理学鉴定:裸鼠肺癌模型建立方案研究结束后,采用颈椎脱臼法处死裸鼠,无菌取出肿瘤,以4%多聚甲醛固定,常规石蜡切片,HE染色,光镜观察肿瘤组织的病理变化。⑵GALV.fus基因系统治疗肺腺癌的体内试验研究①裸鼠肺癌模型的建立及分组:本实验采用细胞悬液接种法。选用4-6周裸鼠28只,将肺癌细胞用PBS配成5×107细胞/ml的细胞悬液。在小鼠右侧背腹部皮下接种0.2m1细胞悬液。观察小鼠肿瘤生长情况,当肿瘤生长至直径约为7mm时,选用瘤体大小一致的荷瘤裸鼠25只,随机分为A-E共5组,每组5只,所余荷瘤裸鼠3只为F组。A组为PBS对照组;B组为Baco-1组;C组为Synco-1组;D组、E组为Synco-2组,其中E组为肿瘤组织GALV.fus表达检测组;F组为体内细胞毒性试验组。②重组单纯疱疹病毒体内细胞毒性试验:F组荷瘤裸鼠3只于第1、7天经尾静脉注射Synco-2纯化病毒液1×108pfu 0.1ml。首次注射14天后,脱颈处死,无菌取出裸鼠脑、心、肺、肾、脾、小肠、肝脏组织,以4%多聚甲醛固定,常规石蜡切片,HE染色,光镜观察肿瘤组织的病理变化。③重组单纯疱疹病毒治疗肿瘤的疗效观察:B组为Baco-1组,C组为Synco-1组,D、E组为Synco-2组,于第1、7天每组裸鼠肿瘤内分别注射纯化病毒液1×108pfu 0.1ml;A组为对照组,裸鼠体内仅注射PBS。自注射病毒开始,每4天测量肿瘤大小,计算肿瘤的体积,描绘肿瘤的生长曲线,共观察4周。观察结束后处死裸鼠,解剖观察瘤体的大体形态,取对照组和治疗组的肿瘤组织称重。④荷瘤鼠肿瘤组织GALV.fus的表达1)首次注射纯化病毒液后2周提取E组Synco-2病毒感染肿瘤组织5例总RNA,RT-PCR法检测受染细胞GALV.fus基因的表达鉴定。2)分别提取已感染病毒肿瘤组织及对照未感染病毒肿瘤组织各1例的总蛋白,以Western Blot法鉴定GALV.fus基因的表达。结果:⑴裸鼠肺癌模型建立方案的研究:1X107个/只细胞接种组接种约3-4天即可见直径约3-4mm大小皮下结节,2周后肿瘤体积增大明显,裸小鼠右背侧皮下均可见0.7cm左右的肿瘤,成瘤率达100%,且动物生长状态良好;1X109个/只细胞接种组亦全部成瘤,但肿瘤体积较小,约0.4cm左右;而低细胞数量组成瘤率为60% (3/5)。组织块接种法成瘤潜伏期为7-10天,接种后即可见质地较硬的接种块大小的皮下结节,约经过7-10天的潜伏期后肿瘤逐渐长大,生长速度比细胞接种组快,成瘤率为100%。⑵重组单纯疱疹病毒对荷瘤裸鼠肺癌的疗效观察:BALB/C裸鼠皮下接种A549细胞2周后,可见所有的裸鼠均有肿瘤生长,成瘤率为100%,肿瘤直径约0.6cm-0.7cm,瘤体大小一致,随机分组实验。A组、B组裸鼠肿瘤呈持续快速生长,生长曲线大致相同,肿瘤体积无显著性差异(p>0.05),说明单纯疱疹病毒本身对肿瘤生长无明显抑制作用;而经过synco-1、synco-2治疗的裸鼠,显示出明显的肿瘤抑制作用,其体积显著低于各对照组(p<0.01);于第一次治疗后5周处死小鼠,取肿瘤称重,肿瘤生长明显减慢,PBS组瘤重为2.412±0.55 , Baco-1组瘤重为1.522±0.61,而synco-1组瘤重为0.544±0.07,synco-2组瘤重为0.467±0.09,与PBS及Baco-1对照组相比,治疗实验组肿瘤显著减小(p<0.01)。synco-1及synco-2组间未见统计学差异(p>0.05)。⑶重组单纯疱疹病毒体内细胞毒性试验:Synco-2尾静脉注射后14天,组织标本病理检测,心、肺、肝、脑、肾、脾、小肠组织形态学观察显微镜下仔细观察,与正常组织对照形态学上无显著区别,说明Synco-2治疗对裸鼠内脏组织无损害。⑷荷瘤鼠肿瘤组织GALV.fus的表达:Synco-2受染肺腺癌荷瘤组织细胞经RT-PCR法及Western Blot在转录及蛋白表达水平上均证明GALV.fus基因表达,而未感染病毒肿瘤组织检测产物无GALV.fus基因表达,结论:1本研究成功包装了已构建的分别由UL38启动子和CMV启动子调控的携带GALV.fus基因和EGFP基因的重组嗜肿瘤单纯疱疹病毒HSV-UL38P-GALV.fus、HSV-CMVP-GALV.fus和HSV-CMVP-EGFP。对其进行纯化、扩增后具有较高的滴度,并在肝癌细胞株HepG2中以RT-PCR法检测到受染细胞GALV.fus基因的表达。2重组嗜肿瘤单纯疱疹病毒HSV-UL38P- GALV.fus和HSV-CMVP- GALV.fus能特异性转染并杀伤肺腺癌A549细胞,其转染效率随MOI的增高而增加;UL38启动子控制下的重组嗜肿瘤单纯疱疹病毒Synco-2在正常细胞HFL-I GNHu5无明显杀伤作用,具有明显的靶向性治疗作用。3用细胞悬液接种法和组织块接种法成瘤率相当,两者均为建立肺癌模型的理想方法。异种动物移植A549细胞后,重组嗜肿瘤HSV-I病毒系统对体内肺癌肿瘤的生长有明显抑制作用。体内应用Synco-2无明显毒副作用,可进一步进行肿瘤全身转移治疗研究。