论文部分内容阅读
葛根汤,来源于东汉张仲景的《伤寒论》,是具有代表性的经方之一。葛根汤为解表剂,具有发汗解表,升津舒筋的作用,在临床上主要应用于肩周炎、病毒性肠炎、风寒感冒等疾病。葛根汤在抗炎方面临床应用比较成熟,但其具体的抗炎分子机理尚不清楚,因此以2015版中国药典记载的葛根汤处方为例,研究体内抗炎活性,以LPS激活RAW 264.7细胞建立炎症模型,探究葛根汤的抗炎分子机制。采用高效液相色谱法（HPLC）对葛根汤组方各中药材的指标性成分进行含量测定,评价葛根汤各组方中药材的质量。随机抽取两批葛根汤中药材进行测定,实验结果表明各组方中药材中指标性成分的含量均符合2015版药典规定。按照2015版中国药典记载的方法制备葛根汤溶液。取葛根和麻黄温浸30 min,与桂枝、白芍、甘草、生姜和大枣五味药材合并一起进行煎煮两次,每次30 min,合并煎液,减压浓缩至一定相对密度,即得葛根汤溶液,供后续实验使用。通过检测葛根汤对角叉菜胶致大鼠足肿胀作用和二甲苯致小鼠耳肿胀作用两个急性炎症模型来研究葛根汤的体内抗炎活性。角叉菜胶致大鼠足肿胀和二甲苯致小鼠耳肿胀实验结果表明,葛根汤能够抑制角叉菜胶致大鼠足肿胀和二甲苯致小鼠耳肿胀,与模型组相比,葛根汤给药组肿胀程度明显降低,且抑制作用优于市售的葛根汤颗粒组。以LPS刺激小鼠巨噬细胞为模型探究葛根汤的抗炎作用机制。LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7诱导其发生炎症反应,激活MAPKs和NF-?B信号通路,释放NO、PGE2等炎症介质以及IL-6、TNF-α等炎性因子,研究葛根汤对MAPK和NF-?B信号通路的作用以及炎性因子水平的影响。MTT法评价葛根汤的细胞毒性,实验结果显示葛根汤在10 mg/mL40 mg/mL浓度范围内对RAW 264.7细胞无明显的细胞毒性;Griess法检测葛根汤对小鼠巨噬细胞释放炎症介质NO的影响,结果表明葛根汤对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7释放炎症介质NO具有显著的抑制作用;ELISA法检测葛根汤对细胞释放TNF-α、IL-6、PGE2的作用,实验结果显示,葛根汤对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7释放炎症介质PGE2和炎性因子IL-6、TNF-?均具有显著的抑制作用;Western blot法检测葛根汤对iNOS、COX-2、p-p38、p-ERK、p-JNK以及IκB-α和核内p65蛋白表达水平的影响,探究葛根汤对NF-κB以及MAPK炎性信号通路的调控机制。实验结果表明,葛根汤能够显著抑制LPS诱导的炎性蛋白iNOS、COX-2的高表达,并能够阻断ERK/JNK/MAPKs蛋白的磷酸化,并且微弱的抑制IκB-α蛋白的降解以及NF-κB/p65蛋白的转位入核。综上所述,葛根汤主要通过阻断ERK/JNK/MAPKs蛋白磷酸化和在一定程度上抑制IκB-α/NF-κB降解及p65/NF-κB信号转导通路的激活,下调iNOS、COX-2蛋白高表达,从而抑制巨噬细胞产生炎症介质NO、PGE2以及炎性因子TNF-?和IL-6等而发挥抗炎作用。