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研究背景:阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是神经退行性疾病中最为流行的一种,最主要的病理特征之一是细胞内病理性tau的异常聚集。而tau最先出现病理性改变的脑区为内嗅皮层（Entorhinal cortex,EC）。近期有研究表明,tau的异常聚集不仅能在细胞内沉积形成神经纤维原缠结,而且能够通过多种形式,以内嗅皮层为起始脑区向外传播,导致临近脑区或者有突触联系的其他脑区成扩散样病理改变。但是传播的具体机制尚不清楚。Tau的乙酰化是tau重要的翻译后修饰,在阿尔茨海默病患者或转基因小鼠的大脑中,我们观察到tau的K174,K274,K280和K281位点乙酰化增加,有研究表明,tau的乙酰化升高会导致病理性tau聚集增多,降解出现障碍。那么异常聚集的tau的传播是否受tau乙酰化的影响,尚不清楚。目的:研究内嗅皮层和海马区tau蛋白乙酰化对其传播及学习记忆功能的影响。方法:使用体重没有明显差异、健康成熟的野生型雄性小鼠作为实验对象。构建模拟tau乙酰化的病毒AAV-Tau-4Q和模拟非乙酰化tau的病毒AAV-Tau-4R,以及未突变的野生型tau病毒AAV-Tau-WT和空载病毒AAV-Vec作为对照。病毒带有P2A水解元件,AAV-syn-e GFP-2a-tau-3flag,与e GFP蛋白非融合,2a遇水断开,使tau与GFP蛋白共表达后解离,不影响tau的传播。使用脑立体定位注射在小鼠EC区或者DG区过表达tau病毒,对照组注射空载病毒。设置时间梯度来观察过表达病毒对小鼠学习记忆和情绪的影响,以及EC区到投射脑区的传播情况。使用新事物识别（Novel object recognition,NOR）,水迷宫（Morris water maze,MWM）和场景恐惧（Fear condition,FC）行为学检测小鼠学习记忆能力;采用开放旷场（Open field,OF）和高架十字迷宫（Elevated plus maze,EPM）检测小鼠情绪变化;采用MED64离体微电极阵列记录系统检测长时程增强效应（LTP）;采用免疫组化和免疫荧光检测tau的传播和胶质细胞的激活状态。结果:1.AD模型鼠的EC区tau蛋白的乙酰化水平升高与WT小鼠相比,AD模型鼠的EC区tau蛋白赖氨酸位点174和280乙酰化水平明显升高。2.EC区过表达Tau-4Q 3个月或6个月不引起tau蛋白向海马区传播、不导致学习记忆损伤在C57小鼠EC区过表达tau蛋白3个月后,除了在EC区可见小胶质细胞明显激活外,在海马的DG区未见明显胶质细胞激活、未见明显tau蛋白向海马区传播、小鼠未见明显学习记忆损伤。过表达tau蛋白6个月后,在EC区可见小胶质细胞和星形胶质细胞明显激活,但未见明显tau蛋白向海马区传播、小鼠未见明显学习记忆损伤。3.EC区过表达Tau-4Q 13.5个月促进tau蛋白向海马DG区传播并导致小鼠出现学习记忆损伤在C57小鼠EC区过表达tau蛋白13.5个月后,表达tau的三个组在EC区小胶质细胞和星形胶质细胞明显激活,且Tau-4Q组激活更加明显;表达Tau-WT诱导tau传播到齿状回（Dentate gyrus,DG）的颗粒细胞层,而表达Tau-4Q促进tau传播到DG的内层;表达tau蛋白的三个组在DG区小胶质细胞和星形胶质细胞都有不同程度的激活,且Tau-4Q组激活更加明显,小鼠出现记忆功能损伤。4.海马DG区过表达Tau-4Q促进tau蛋白向对侧传播并加重Tau-WT-引起的突触和记忆损伤在C57小鼠单侧DG区过表达tau蛋白8周后,在Tau-4Q小鼠对侧海马中HT7阳性细胞数比Tau-WT小鼠多,过表达Tau-4R消除了tau向对侧海马的传播;过表达Tau-4Q在海马DG区同侧和对侧诱导非常明显的小胶质细胞和星形胶质细胞激活,在Tau-WT组只有同侧海马中有较少的胶质细胞激活;过表达tau的三组EPSP斜率均下降,而在Tau-4Q组下降最为明显,Tau-WT组和Tau-4R组之间没有差异;表达Tau-WT和Tau-4Q损伤小鼠学习记忆能力,Tau-WT,Tau-4Q和Tau-4R导致情绪障碍,Tau-WT和Tau-4Q之间没有差异,Tau-4R恢复小鼠学习记忆能力。结论:Tau蛋白乙酰化促进其从EC向DG区的时间依赖性传播;单纯EC区tau蛋白聚集不损伤学习记忆功能;海马区tau蛋白聚集可导致认知功能缺陷。研究背景:阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是神经退行性疾病中最为流行的一种,最主要的病理特征之一是细胞内病理性tau的异常聚集。最近的一项研究发现,与脑脊液（cerebral spinal fluid,CSF）磷酸化tau T181相比,早期轻度认知障碍（mild cognitive impairment,MCI）和AD患者血浆中tau T217的磷酸化作为AD的早期预测,比已建立的基于血浆和MRI的生物标记物具有更高的准确性,可以更好地与其他神经退行性疾病区分开。然而,tau T217的早期磷酸化对AD病理过程的影响尚不清楚。目的:研究tau T217-磷酸化的毒性作用。方法:在本研究中,使用体重没有明显差异的、健康成熟的野生型雄鼠作为实验对象。构建模拟tau磷酸化的病毒AAV-tau-T217E和模拟非磷酸化tau的病毒AAVtau-T217A,以及未突变的tau病毒AAV-tau-WT和空载Vec作为对照。病毒带有P2A水解元件,AAV-syn-e GFP-2a-tau-3flag,与e GFP蛋白非融合,2a遇水断开,使tau与GFP蛋白共表达后解离,不影响tau的传播。使用脑立体定位注射在小鼠CA3区过表达tau病毒,对照组注射空载病毒。使用新事物识别（Novel object recognition,NOR）,水迷宫（Morris water maze,MWM）和场景恐惧（Fear condition,FC）行为学检测小鼠学习记忆能力;采用开放旷场（Open field,OF）和高架十字迷宫（Elevated plus maze,EPM）检测小鼠情绪变化;采用免疫组化和免疫荧光检测tau的传播和胶质细胞的激活状态。使用蛋白免疫印迹法检测蛋白质表达。使用高尔基染色法检测树突棘数目变化。使用体外重组tau检测蛋白聚集。结果:1.3x Tg小鼠海马中tau-T217磷酸化水平升高通过蛋白质印迹技术,我们观察到在3月龄和6月龄的海马中tau-T217磷酸化的水平显著增加。通过免疫组织化学技术,我们观察到tau在小鼠CA3区早期就出现tau-T217磷酸化水平升高。2.模拟tau-T217磷酸化可增强tau其他位点的磷酸化,同时抑制tau降解并增加其聚集HEK293细胞转染质粒48小时后,与野生型tau和tau-T217A组相比,过表达tau-T217E显著增加了tau其他位点的磷酸化水平,抑制了tau降解。通过体外纯化蛋白实验,用硫黄素T染色,与野生型tau和tau-T217A组相比,tau-T217E的聚集显著增强。3.模拟tau-T217磷酸化加重Tau-WT引起的小鼠认知功能损伤在小鼠海马CA3中过表达tau病毒一个月后,不同类型的tau会引起认知功能障碍,tau-T217E组的变化比野生型tau和tau-T217A组更显著,T217A的突变恢复了小鼠的行为表现。4.模拟tau-T217磷酸化加重tau病理和树突棘损伤在小鼠海马CA3中过表达tau病毒一个月后,与野生型tau相比,过表达tau-T217E显著增加了tau在T181,T205,S214,T231,S262和S422的磷酸化水平,并显著提高了截短的tau-N368（经AEP剪切的tau）和tau-C3的水平（半胱天冬酶在Asp421上剪切的tau）。通过高尔基染色,所有表达tau的组在海马CA3中神经元树突棘的数量明显减少。以上,在过表达tau-T217A组恢复到野生型tau组的水平。5.模拟tau-T217磷酸化加重Tau-WT引起的神经胶质细胞激活,但不影响tau蛋白传播在小鼠海马CA3中过表达tau病毒一个月后,所有tau表达组在同侧和对侧海马CA3中均观察到小胶质细胞激活,并且在tau-T217E组中激活最为明显,并且T217A使IBA1恢复至正常对照水平。对于星形胶质细胞,过表达tau只能诱导同侧的星形胶质细胞激活,其程度与IBA1类似,但不会影响对侧。6.在tau-P301L基础上模拟T217磷酸化没有进一步增加tau其他位点的磷酸化HEK293细胞转染质粒48小时后,过表达的tau-L,tau-LE,tau-LA不会在tau的S202,T205,S214,T231,S262,S396位点诱导磷酸化进一步升高。7.在tau-P301L基础上模拟T217磷酸化虽然会加重tau剪切,但是不会恶化认知障碍在2月龄小鼠CA3过表达病毒一个月后,过表达tau-P301L-T217E显著增加了被剪切的tau-N368的水平,但不影响其在T181和S214处的磷酸化,并且通过开放旷场,新事物识别和水迷宫实验测得,所有三种类型的tau诱导的行为异常水平相似。8.在tau-P301L基础上模拟T217磷酸化促进tau传播和神经胶质细胞激活在2月龄小鼠CA3过表达病毒一个月后,在tau-LE组的对侧海马CA1上有明显的HT7阳性信号。通过IBA1和GFAP免疫荧光染色,我们还观察到T217磷酸化加剧了tau-P301L诱导的神经胶质细胞激活。结论:基于野生型tau的T217模拟磷酸化加剧了tau诱导的其他位点磷酸化,加重了tau的裂解,纤维化和小鼠的认知障碍,而基于P301L的T217的模拟磷酸化虽然促进了tau的传播和裂解,但是不会加重其他位点的磷酸化,也不会加剧认知能力缺陷。