血栓性疾病(Thrombotic diseases)是一类严重危害人类健康的疾病,已成为我国与西方国家人口死亡和致残的主要原因。它主要包括动脉血栓性疾病和静脉血栓性疾病,常累及全身多个脏器,涉及临床各学科。尽管目前有关抗血栓药物的研究工作取得了较大进展,但出血和再狭等风险使得对抗栓药物的选择仍存争议,此外,当心脑血管病患者就医时,血栓往往已形成并导致了血管栓塞,而这些脏器缺血后再治疗效果不佳。由此可见,在抗血栓治疗中,研制副作用小、特异性强、适用于早期使用的靶向抗血栓制剂具有重大意义。组织因子(Tissue factor, TF)是一种分子量为47kD的跨膜糖蛋白,作为血浆凝血因子Ⅶ(Coagulation factorⅦ, FⅦ)的受体启动外源性凝血过程。研究表明,TF除了在正常止血方面的作用外,其异常表达与脑血栓、动脉粥样硬化、急性冠脉综合症、深静脉血栓、弥散性血管内凝血、炎症及肿瘤等密切相关,日益受到广泛关注。有关靶向TF的研究,在血栓的诊疗领域前景十分看好。目前有关TF及其配体FⅦ的研究发现,FⅦ上类表皮生长因子Ⅰ区多肽(First epidermal growth factor-like domain, EGF1)是与TF结合的重要配体,该肽段具有结合TF功能而无促凝活性,因此EGF1肽可基于配／受体的相互作用而成为靶向TF制剂的导向功能基。纳米技术是靶向制剂研究中的热门之一,纳米粒介导的靶向治疗是通过纳米粒子作为载体,包裹药物(核苷酸、蛋白或小分子化合物),同时在纳米粒表面连接具有导向功能的靶头,将药物递送到靶向部位,提高药物在局部的浓集和释放,从而实现靶向干预治疗。目前临床上,有关纳米粒介导的靶向抗肿瘤治疗已经取得了显著成效,而有关血栓性疾病的纳米靶向治疗并不多见,伴随着纳米技术的成熟,在血栓性疾病的诊治中运用纳米靶向技术已成为可能。本研究将近年来兴起的纳米技术与生物医学技术相结合运用于血栓性疾病的靶向治疗之中。构建出具有TF靶向性蛋白修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒,结合基因干预手段,运载针对TF上游调控点NF-κB的decoy ODNs,通过动物体内外实验验证这种新型纳米载体的生物靶向效应,实现对脑血栓形成部位靶向干预的目的。目的：构建含有大鼠FⅦ上EGF1编码区基因的融合基因表达载体pET28a-EGFP-EGFl,以获得由绿色荧光蛋白标记的EGFP-EGF1融合蛋白,为研究EGF1片段的生物学功能打下基础。方法：通过RT-PCR法从大鼠肝脏获得凝血因子Ⅶ上EGF1编码区基因,将其插入带有增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)标记的pET28a-EGFP质粒上构建重组表达载体pET28a-EGFP-EGF1,经过化学转染法将该原核表达载体转入大肠杆菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后获得EGFP-EGF1融合蛋白,并采用亲和层析方法,经镍柱纯化融合蛋白,应用免疫印迹、质谱分析等方法对所表达的EGFP-EGF1蛋白进行分析鉴定。结果：大鼠FⅦ上EGF1编码区基因被有效扩增,重组的原核表达载体pET28a-EGFP-EGF1经过酶切、DNA测序鉴定表明与设计一致,无突变发生,EGFP-EGF1蛋白在大肠杆菌中得到稳定表达,每升菌蛋白产量约为1.2-1.6 g/L,蛋白质纯度约为84.6%,分子量约为36 kD左右。结论：成功构建了原核表达载体pET28a-EGFP-EGF1,该表达载体可在大肠杆菌中稳定表达EGFP-EGF1融合蛋白。目的：探讨EGFP-EGF1蛋白与TF的结合功能及其促凝血功能,为将其用于TF靶向性给药系统奠定实验基础。方法：通过脂多糖(LPS)刺激的方法建立大鼠血管内皮细胞高表达TF体外模型,以此模型为基础使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察EGFP-EGF1蛋白与细胞膜表面TF结合情况；采用流式细胞仪检测EGFP-EGF1蛋白与细胞膜表面TF结合能力；应用表面等离子共振相互作用分析仪(SPR)实施监测EGFP-EGF1蛋白与游离组织因子(sTF)的结合曲线,并计算相关结合常数；利用全自动凝血分析仪测定EGFP-EGF1蛋白的凝血酶原时间(PT),评价其促凝血功能。结果：以1.0μg/ml LPS共孵育4 h的诱导方法成功建立了大鼠血管内皮细胞高表达TF体外模型；荧光显微镜、激光共聚焦显微镜可明显观察到与模型细胞表面TF相结合的EGFP-EGF1蛋白；在流式细胞仪检测中,模型细胞表面荧光蛋白表达率约为68.65±3.86%,该荧光蛋白表达率与EGFP-EGF1蛋白浓度成正比,且明显强于加入重组大鼠凝血因子Ⅶ(rFⅦ)组(57.98±4.71%,P<0.01)。SPR检测示EGFP-EGF1蛋白与sTF结合常数明显高于rFⅦ((8.29±1.39 VS 3.75±0.32,P<0.01))。同时,EGFP-EGF1蛋白PT较对照明显延长(56.8±3.2 s VS 17.8±3.4 s,P<0.01)。结论：成功建立了大鼠血管内皮细胞体外高表达TF模型,为体外结合功能研究提供了实验平台；EGFP-EGF1蛋白能与细胞膜表面TF及sTF高效结合,并与rFⅦ有竞争性结合TF功能,EGFP-EGF1蛋白无促凝血活性。目的：构建以EGFP-EGF1蛋白为靶头修饰的聚乙二醇聚乳酸(PEG-PLA)纳米粒并对其理化性质进行表征。方法：运用复乳／溶媒蒸发法制备PEG-PLA纳米粒,将巯基化后的EGFP-EGF1蛋白通过连接于PEG-PLA纳米粒表面构建出EGFP-EGF1蛋白修饰PEG-PLA纳米粒,同时在纳米粒内分别包裹示踪剂(近红外染料Dir)及寡核苷酸片段(针对TF上游调控点NF-kB decoy ODNs),应用透射电镜观察、免疫胶体金标记、粒径电位测量等技术对纳米粒性状及外观结构进行表征；采用离心法检测各组纳米粒所载药的包封率及释放率；通过CCK8法检测各组纳米粒对体外正常大鼠血管内皮细胞生长的影响。结果：EGFP-EGF1蛋白修饰PEG-PLA纳米粒及载药前后各组纳米粒外形规则,大小均一,粒径在100 nm左右,可明显看到EGFP-EGF1蛋白均匀分布于纳米粒表面；zeta电位测定示各组纳米粒均带负电位；纳米粒对Dir的包封率为2.113±0.066%,1h至4h释放率仅为0.9±0.20%至1.6±0.20%,基本无释放；对Decoy ODNs的包封率为0.16125±0.01375%,48h至96h释放率为40.60±4.05%至45.99±4.71%,具有良好缓释性；小于5 mg/ml浓度纳米粒对细胞增殖无明显影响,当Decoy ODNs EGFP-EGF1-NP浓度达到10 mg/ml时,细胞增殖活性受到影响。结论：成功制备了由TF靶向性蛋白EGFP-EGF1修饰的PEG-PLA纳米粒,通过表征证实其理化性质可基本满足载药要求,同时具有低毒性。目的：检测EGFP-EGF1蛋白修饰PEG-PLA纳米粒在体外与TF相结合,在体内靶向高表达TF血栓部位的能力,探讨将该纳米粒用于TF靶向性给药的可行性。方法：采用LPS诱导法建立大鼠血管内皮细胞高表达TF体外模型,光化学诱导法建立大鼠脑血栓模型；运用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪在体外观测纳米粒与细胞膜表面TF结合情况；通过直接荧光观察和体内活体成像技术检测纳米粒靶向脑血栓形成部位及在体内脏器的分布。结果：采用注射玫瑰红B及光诱导的方法建立了大鼠脑血栓模型,血栓部位高表达TF；荧光显微镜、激光共聚焦显微镜可明显观察到EGFP-EGF1蛋白修饰纳米粒与模型细胞表面TF相结合；在流式细胞仪检测中,模型细胞表面荧光率约为65.23%,该荧光率与纳米粒浓度成正比；脑部荧光浓集于高表达TF的血栓部位。结论：成功建立了大鼠脑血栓模型,并通过体外及体内模型试验证实EGFP-EGF1蛋白修饰的PEG-PLA纳米粒具有靶向细胞膜上TF及脑血栓形成部位功能,同时EGFP-EGF1蛋白纳米粒在体内主要分布于脑血栓部位、脾脏、肝脏及肺部。目的：检测载针对TF调控的寡核苷酸片段(decoy ODNs)后EGFP-EGF1蛋白修饰PEG-PLA纳米粒对体外细胞表达TF及体内血栓形成的影响。方法：采用LPS诱导法建立大鼠血管内皮细胞高表达TF体外模型,运用RT-PCR及Western blotting检测载Decoy ODNs EGFP-EGF1-NP对模型细胞TF mRNA和蛋白表达的影响；采用光化学诱导法建立大鼠脑血栓形成模型,通过免疫组化及血栓面积测定等方法评价注射载Decoy ODNs EGFP-EGF1-NP后对脑血栓形成的影响。结果：人工合成了针对TF转录调节上游位置的decoy ODNs,体外实验证实该片段能明显降低TF转录及表达水平；同时载有该片段的EGFP-EGF1蛋白修饰PEG-PLA纳米粒能明显抑制细胞膜表面TFmRNA及蛋白表达：同时在造模时注射载Decoy ODNs EGFP-EGF1-NP后,可明显减少大鼠脑血栓形成(P<0.01)。结论：针对TF的NF-κB decoy ODNs可明显抑制TF转录及表达,载decoy ODNs EGFP-EGF1蛋白纳米粒能提高抑制效率：预防性使用载decoy ODNs EGFP-EGF1蛋白纳米粒,可减少大鼠脑血栓形成。