单克隆抗体（简称单抗）是最重要的生物技术药物之一,在细胞表达和生产等环节会形成电荷异质体,导致电荷量及表面电荷分布与目标单抗存在差别,对药物药效产生潜在影响,一般通过离子交换层析进行分离。由于主体单抗和电荷异质体之间的结构和性质十分相似,常规层析分离中不同组分的洗脱峰交叠十分严重,难以实现高纯度和高收率的分离。近年来发展迅速的连续流层析技术提供了新的思路,可以改善分离效果,但过程相对复杂,影响参数较多,优化较为困难。本文针对单抗电荷异质体的高效分离,比较常规单柱批次层析和双柱连续流层析,优化分离过程,并引入离子交换层析机理模型,建立模型辅助的过程分析方法,促进关键参数的合理优化,为难分离组分的连续流层析过程开发提供指导。首先,探讨常规单柱阳离子交换层析分离单抗电荷异质体,分别对介质粒径、流速、洗脱模式和梯度等分离条件进行优化。发现介质粒径具有重要影响,减小介质粒径,分离能力显著提高。15 μm粒径介质可以实现主体单抗与电荷异质体的完全分离,在0.05 pH/CV和100 cm/h条件下,主体单抗纯度接近100%,收率为56.5%。两种梯度洗脱模式,pH梯度和盐梯度,均适用于单抗电荷异质体分离,随洗脱梯度变缓、流速减小,分离效果改善。研究中发现,洗脱梯度斜率和流速之间存在交互作用,梯度斜率对收率影响较大,流速对过程产率影响较大。阳离子交换层析分离电荷异质体时,可以采用较缓的洗脱梯度和较大的流速,以提高目标单抗的分离效率。其次,考察双柱连续流层析分离单抗电荷异质体,采用多柱逆流溶剂梯度纯化（MCSGP）模式,通过交叠组分的循环上样,在保证目标蛋白纯度的同时,提高收率。结果表明,对于模型蛋白体系和单抗蛋白样品,MCSGP都能提高目标蛋白收率。但是,相较于单柱批次层析,MCSGP过程的洗脱流速和蛋白上样组成均发生改变,洗脱峰的保留时间和峰形分布存在差异。研究发现,常规MCSGP过程设计以单柱批次层析的洗脱曲线为设计原型,工作区间的选取不够合理,造成实际收集区间与设计谱图略有漂移,影响了目标蛋白纯度和收率。为了改善分离效果,提出改进的MCSGP过程设计方法,称为reMCSGP,以常规MCSGP过程的蛋白洗脱曲线为设计原型,进行工作区间的优化。对于模型蛋白体系,在保证目标蛋白纯度大于95%条件下,相比于常规MCSGP,reMCSGP收率从83.6%提高至97.8%。对于单抗蛋白样品,reMCSGP能够保证目标单抗纯度大于84.0%,收率提高至93.9%,较两组常规MCSGP分别提高15.4%和20.7%。为了增强对MCSGP过程的理解,引入机理模型,结合平衡扩散模型和空间质量作用模型,构建离子交换层析模型;在此基础上整合MCSGP过程模型,建立MCSGP过程的模型表征。结果表明,模型预测的MCSGP洗脱曲线与实验结果吻合良好,进一步证实reMCSGP过程设计策略可以很好解决常规MCSGP存在的问题,验证了 reMCSGP的合理性和必要性。借助模型,对MCSGP过程的关键参数进行了系统评价。发现蛋白上样量越大,各组分保留时间减小越明显,目标蛋白收率严重降低;稀释起始点处对应的电导值过大,会导致部分蛋白被提前淋洗出来,影响目标蛋白收率;若各组分交叠程度相对较低,收集区间起始点主要影响收率,适当左移以扩大目标蛋白收集区间,能够提高收率。最后,针对单抗电荷异质体的富集和结构鉴定,比较了常规单柱批次层析的放大和双柱N-rich连续流层析新型分离模式。对于单柱批次层析,从4.15 mL放大至88.20 mL层析柱,分离并浓缩收集液,得到1.19 mg酸性电荷异质体,收率为59.2%。对于双柱N-rich连续流层析,采用2根3.93 mL层析柱,经22次循环分离,得到1.33 mg酸性电荷异质体,收率达到86.2%。在相同蛋白处理量下,N-rich连续流层析可以显著减小层析柱尺寸,提高收率,降低介质和层析柱设备成本。此外,采用LC-MS/MS对分离得到的酸性电荷异质体进行了结构鉴定,得到了一些有价值的结构信息。综上所述,本文针对单抗电荷异质体的分离和富集,系统比较了常规单柱批次层析和双柱连续流层析新技术,证实了连续流层析具有改善分离效果、提高过程产率等优势。针对连续流层析过程的复杂性,引入机理模型,探究关键参数的影响,增强对过程的理解,有助于MCSGP等连续流层析过程的优化设计。