利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除家蚕中部丝腺的let-7 microRNA后,中部丝腺细胞的DNA含量和ATP含量显著增加,中部丝腺增长变粗,但部分丝胶蛋白残留在丝腺腔,蚕丝产量下降。通过microRNA靶基因预测、转录组测序和双荧光素酶实验证明了丙酮酸羧化酶（PC）是let-7在中部丝腺的靶基因。当PC在中部丝腺特异高表达时,中部丝腺出现了与let-7敲除相似的表型,但在中部丝腺敲除PC后未出现异常表型,可能是因为PC的缺失能被其他基因或其他代谢调控通路补偿,这些基因也可能是let-7的靶基因。本研究利用TMT标记定量蛋白组学的方法,从蛋白水平筛选出中部丝腺敲除let-7后的差异表达基因,再结合microRNA靶基因预测和双荧光素酶实验鉴定let-7在中部丝腺的靶基因;利用UHPLC-QTOF-MS非靶标代谢组学检测let-7敲除后家蚕中部丝腺代谢物的变化;蛋白组学与代谢组学关联分析,找到let-7调控中部丝腺生长发育的关键通路;最后,在细胞水平探索let-7及其靶基因对家蚕细胞增殖的作用,为进一步在家蚕个体上揭示let-7调控中部丝腺生长发育的分子机制提供理论依据。目前获得的研究结果如下:1.家蚕中部丝腺let-7敲除后蛋白组学分析利用TMT标记定量蛋白组学技术,定量检测了let-7敲除后五龄三天家蚕中部丝腺里的蛋白质,对差异蛋白进行功能分析。在6个实验组中共提取到5,866个蛋白质,经数据预处理保留了5,850个。按P-value＜0.05且Fold change＜0.83或Fold change＞1.2的筛选标准,共筛选到207个差异表达蛋白,其中135个下调表达,72个上调表达,接着对筛选到的差异表达蛋白进行GO注释富集分析和KEGG Pathway富集分析。GO注释富集结果显示,差异表达蛋白富集最多的是在有机金属化合物生物合成和代谢过程,其次是在核苷酸生物合成和代谢、ATP生物合成等生物学过程;KEGG Pathway富集结果显示,差异表达蛋白在新陈代谢通路中富集最多,有10个差异表达蛋白,其次是在鞘糖脂生物合成通路、糖胺聚糖降解、其他多糖降解通路、嘌呤代谢和支链氨基酸（缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸）的降解等通路。这些结果说明let-7可能通过影响中部丝腺细胞中的ATP合成和核苷酸代谢通路来调控家蚕中部丝腺的生长发育和中部丝腺的生物学功能。2.家蚕中部丝腺let-7敲除后代谢组学分析运用非靶标代谢组学技术对五龄三天家蚕的中部丝腺进行检测,样品包括let-7敲除组（KO-M）8个生物学重复和对照组（WT-M）8个生物学重复。正、负离子模式下在3个质控样本和16个实验样本中共提取了7,350个代谢物,通过对原始数据预处理保留了5,874个代谢物。对这5,874个代谢物进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）,对照组（WT-M）和敲除组（KO-M）彼此分开,说明let-7敲除导致了家蚕中部丝腺的代谢物发生了改变;按照VIP＞1和p值＜0.05的标准筛选到488个差异代谢物,其中230个上调,258个下调;按照每一类中至少包含两个差异代谢物的标准,这488个差异代谢物可分为18类,其中差异代谢物最多的一类是羧酸及其衍生物;对差异代谢物进行KEGG Pathway富集和代谢通路富集分析,KEGG Pathway富集结果显示,差异代谢物主要富集在嘧啶代谢通路,其次是在泛酸/辅酶A的生物合成通路、β-丙氨酸代谢通路和嘌呤代谢通路;代谢通路富集结果显示,与差异代谢物最相关的通路是泛酸/辅酶A的生物合成,其次是β-丙氨酸代谢和组氨酸代谢通路以及嘧啶代谢通路。这些结果说明let-7通过调节家蚕中部丝腺中的核苷酸代谢以及能量代谢参与家蚕中部丝腺的生长发育。蛋白组学和代谢组学关联分析的结果表明,let-7调控中部丝腺的关键通路是能量代谢通路和核苷酸代谢通路。其中关联到的差异蛋白包括下调表达的腺苷酸激酶（adk2）、黄嘌呤脱氢酶1（Xdh1）和上调表达的核苷二磷酸还原酶小亚基（Rnr S）;差异代谢物包括下调的脲基丙酸（Ureidopropionic acid）、二氢尿嘧啶（Dihydrouracil）、一磷酸鸟苷（GMP）、一磷酸腺苷（AMP）和上调的胞嘧啶（Cytidine）、尿囊酸（Allantoic acid）和5-磷酸脱氧核糖（Deoxyribose 5-phosphate）。下调的天冬酰胺（L-Asparagine）、色氨酸（L-Tryptophamide）和组氨酸（L-Histidine）能进入三羧酸循环产生ATP,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCK）下调使糖异生进程减弱,更利于糖酵解的进行。这些差异表达的蛋白质和代谢物在DNA代谢过程中具有重要作用,说明let-7下调后,丝腺细胞核苷酸代谢和能量代谢通路发生改变,导致家蚕中部丝腺发育异常。3.家蚕中部丝腺let-7靶基因鉴定将蛋白组学筛选到的72个上调表达蛋白和microRNA靶基因预测软件（RNAhybrid、miRanda和Target Scan）预测到的504个候选靶基因求交集,筛选到let-7调控中部丝腺的4个候选靶基因;对4个候选靶基因进行3’RACE扩增,确定了细胞分裂周期蛋白2（cdc2）和中心体蛋白（centrin）的3’UTR序列,并将其构建到双荧光素酶报告基因载体上,与let-7 mimic共转染到293T细胞中,双荧光素酶活测定结果显示,二者的酶活显著下调;通过靶位点突变实验验证了cdc2和centrin 3‘UTR上与let-7结合的有效靶位点。4.let-7及其靶基因对家蚕细胞增殖的作用将let-7 mimic和let-7 antagomir转染到家蚕卵巢细胞系Bm N4-SID1以分别上、下调let-7的表达;Ed U染色结果显示,上调let-7抑制家蚕细胞增殖,下调let-7促进家蚕细胞增殖。合成靶基因cdc2和centrin的双链RNA,通过RNAi下调细胞中cdc2和centrin;Ed U染色结果显示,下调cdc2和centrin均能抑制家蚕细胞增殖,与上调let-7的效果一致。q PCR检测结果显示,let-7上、下调后其靶基因cdc2和centrin在m RNA水平的表达没有明显改变,说明let-7对靶基因cdc2和centrin的调控可能不是引起m RNA降解,而是在转录后水平抑制翻译过程,进而抑制家蚕细胞增殖。