蜜蜂作为重要的特种经济动物,不仅为人类提供丰富的蜂产品,而且在农作物授粉和维持生态系统平衡中发挥重要作用。然而,近年来,世界范围内的蜜蜂数量呈锐减趋势。研究表明,多种环境胁迫因子(包括热激胁迫)是造成蜜蜂数量减少的重要因素。热激胁迫影响蜜蜂的生长、发育和采集能力,危害较大。因此,研究蜜蜂的耐热性,改良和培育耐热蜜蜂新品种是保持蜂群健康发展的重要前提。但是,目前关于蜜蜂抵御热激胁迫的具体分子机制的研究较少。核因子Y(Nuclear Factor Y,NF-Y)是一类重要的转录因子,包括NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基,在动物和植物中普遍存在,是近年来分子生物学研究领域的一个热点。动物NF-Y的研究主要集中在生长、发育、肿瘤、癌症和人类的一些其它疾病上。研究表明,植物NF-Y在热激胁迫反应中发挥重要作用。但是,动物NF-Y响应热激胁迫的分子机制仍然不清楚。本研究以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)为实验材料,首先通过转录组测序技术(RNA-sequencing,RNA-seq)筛选蜜蜂热激胁迫响应基因,并对NF-Y基因家族进行分离鉴定。其次,我们借助分子生物学和细胞生物学等多种方法解析蜜蜂NF-Y基因家族响应热激胁迫的具体分子机制。主要研究结果如下:(1)RNA-seq结果表明,热激胁迫诱导中华蜜蜂包括NF-Y在内的多个基因家族的表达。基因功能注释结果显示,热激胁迫影响蜜蜂的生长、发育、免疫系统和寿命调节等重要的生物学过程及信号通路。这些结果说明,包括NF-Y在内的热响应基因可能在蜜蜂热激胁迫反应中发挥重要作用。(2)生物信息学分析表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂的NF-YA、NF-YB和NF-YC氨基酸序列同源性为100%。尽管中华蜜蜂、意大利蜜蜂和其它动物的NF-Y在基因组结构上差别较大。但是,中华蜜蜂和意大利蜜蜂的NF-YA、NF-YB和NF-YC蛋白都具有典型的NF-Y保守结构域。NF-YA的保守结构域具有2个α螺旋,NF-YB和NF-YC的保守结构域都具有4个α螺旋。我们推测,保守结构域对NF-Y功能的发挥起重要作用。(3)实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)实验结果显示,与对照组相比,在短期和长期热激胁迫条件下,中华蜜蜂和意大利蜜蜂NF-YA、NF-YB和NF-YC的转录水平均被诱导表达。而且,在短期热激胁迫条件下,中华蜜蜂NF-YA的诱导水平明显比NF-YB和NF-YC的诱导水平高;意大利蜜蜂的NF-YA和NF-YB的诱导水平明显比NF-YC高。然而,在长期热激胁迫条件下,中华蜜蜂和意大利蜜蜂NF-YA、NF-YB和NF-YC的转录水平差别不大。我们推测,在短期和长期热激胁迫条件下,NF-YA、NF-YB和NF-YC转录水平的差异是蜜蜂在不同程度的热激胁迫条件下对NF-Y的3个亚基的需求不同。为了进一步验证NF-Y在蜜蜂热激胁迫反应中的作用,我们借助双链RNA介导的基因沉默技术,在中华蜜蜂中沉默了NF-YB和NF-YC基因。随后,我们发现与对照组相比,沉默NF-YB和NF-YC增加中华蜜蜂在热激胁迫条件下的死亡率。这些结果表明,NF-Y在蜜蜂的热激胁迫反应中发挥重要的作用。(4)亚细胞定位分析表明,蜜蜂NF-YA定位在细胞核,NF-YB定位在细胞质,NF-YC在细胞质和细胞核中均有定位。酵母双杂交实验结果表明,NF-YA和NF-YC互作,NF-YB和NF-YC互作,NF-YA和NF-YB不互作。我们利用免疫共沉淀和免疫荧光技术进一步证明了以上结果。而且,我们发现NF-YC通过与NF-YB互作把位于细胞质的NF-YB拉进细胞核。通过把NF-YB和NF-YC蛋白序列分段,我们利用免疫共沉淀和免疫荧光技术发现组蛋白折叠结构域(histone fold motif,HFM)对NF-YB和NF-YC的互作是必须的。此外,免疫荧光实验结果表明,HFM对NF-YB和NF-YC共定位到细胞核是必须的。缺失HFM致使NF-YB和NF-YC都在细胞质中表达。(5)RNA-seq结果显示,沉默NF-YB和NF-YC影响中华蜜蜂包括环境胁迫响应、发育、抗氧化反应和寿命调控等在内的多个重要生物学过程和信号通路。此外,沉默中华蜜蜂NF-YB和NF-YC均可以影响多个热响应基因的表达,尤其是LOC108003540和LOC107994062。与对照组相比,热激胁迫可以明显诱导中华蜜蜂LOC108003540和LOC107994062的转录。但是,当NF-YB和NF-YC沉默后,与对照组相比,热激胁迫对LOC108003540和LOC107994062转录水平的诱导受到抑制。这些结果表明,NF-Y通过调控热诱导基因的表达参与蜜蜂热激胁迫响应。(6)与对照组相比,在氧化剂过氧化氢处理条件下,中华蜜蜂NF-YA、NF-YB和NF-YC的转录水平被诱导表达;在抗氧化剂维生素C处理条件下,中华蜜蜂NF-YA、NF-YB和NF-YC的转录水平被抑制。沉默NF-YB和NF-YC增加中华蜜蜂体内过氧化氢、丙二醛和蛋白质羰基的含量,表明沉默NF-Y增加蜜蜂的氧化损伤程度。此外,RNA-seq及qRT-PCR结果表明,沉默NF-YB和NF-YC降低中华蜜蜂多个抗氧化基因的转录水平。同时,沉默NF-YB和NF-YC也能降低中华蜜蜂抗氧化酶(过氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-S转移酶和过氧化氢酶)的酶活性和维生素C含量,表明沉默NF-Y影响蜜蜂的抗氧化能力。的确,通过对中华蜜蜂抗氧化能力测定,我们发现沉默NF-YB和NF-YC降低中华蜜蜂的总抗氧化能力。这些结果表明,沉默NF-YB和NF-YC影响蜜蜂的抗氧化信号通路,降低蜜蜂的抗氧化能力,增加蜜蜂的氧化损伤程度。综上所述,本研究发现NF-YA、NF-YB和NF-YC在蜜蜂的热激胁迫反应中发挥重要作用。NF-YC通过与NF-YB互作把位于细胞质的NF-YB拉进细胞核发挥作用。NF-Y通过调控热激胁迫响应基因和抗氧化信号系统来参与蜜蜂的热激胁迫反应。NF-Y的上调表达有助于增加蜜蜂的抗氧化能力,减少热激胁迫对蜜蜂造成的氧化损伤,进而增加蜜蜂在热激胁迫条件下的存活率。