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在肿瘤的发生和发展过程中存在着显著的基因组不稳定。在众多能够引起基因组不稳定的因素中,转座因子发挥了相当重要的作用。有研究提示,转座因子可能参与了人类以及其他哺乳动物的肿瘤以及相关疾病的发生或者促进了肿瘤的发生。Alu序列作为逆转录转座因子中最庞大的重复序列家族,在人类基因组中约有100万个拷贝,其对于人类基因组的影响不容忽视。据推测,Alu序列以大约每200个新生儿出现一个新的基因组插入的速度在人类基因组中扩增。估计有0.1%的人类遗传信息异常源于这种Alu序列插入基因组的机制。另外,大约有0.3%的人类遗传信息异常是源于Alu序列相关的重组事件。由Alu序列所引发的基因组不稳定在肿瘤发生中的作用也引起广泛的关注,如Alu序列介入的不等同源重组导致了某些肿瘤细胞中频繁发生染色体重排事件等。本课题则初步研究了肝癌中Alu序列的逆转座情况。 首先,我们根据Alu Ya5的序列设计PCR引物,从人类基因组中获取Alu序列片段,然后重组至pcDNA3.0载体,分别以T7聚合酶和SP6聚合酶转录合成正义和反义RNA探针;对肝细胞癌石蜡切片行原位杂交检测,研究肿瘤组织中包含Alu重复序列的RNA的表达情况。实验结果显示,在肝癌组织中较癌旁组织有明显的阳性信号。接下来我们又对肝癌组织以及癌旁组织中Alu RNA的水平行引物延伸法检测,研究肝癌中Pol Ⅲ(polymerase Ⅲ)转录的Alu RNA是否有增加。实验结果显示,Alu在肝癌组织中远较癌旁肝组织中转录物含量高。最后我们又分别检测了肝癌组织和癌旁组织中逆转录酶活性,推测Alu序列的转录后事件:研磨并裂解组织,离心获取蛋白上清液,以此上清液作为逆转录酶成分加入RT-PCR反应体系,对标准样品RNA行扩增,依据产物的量来标定组织中逆转录酶的活性。实验结果显示,在肝癌组织中逆转录酶的活性有所增加。 Alu序列在基因组中通过RNA介导的逆转座方式不断扩增的过程如下:(1) 在种系细胞或组织中由Pol Ⅲ识别Alu的内部启动子转录成Alu RNA;(2) 在L1(LINE1)等其他带有编码逆转录酶序列的逆转座因子协助下生成cDNA;(3) 随机或者在特定位点插入基因组。 在本课题中,为研究Alu序列在肝癌组织中的逆转座情况,我们首先以原位杂交以及引物延伸等方法检测肝癌组织中Alu RNA的表达水平,初步证实了由第二军医大学硕士生论文Pol nl识别内部启动子转录的Alu RNA在肝癌组织中表达增加,而后肝癌组织中逆转录酶活性增高的实验结果则提示Alu转录物可能在某些特定来源的逆转录酶作用下合成Alu cONA。