论文部分内容阅读
木质纤维素是自然界分布广泛的可再生资源,其高效转化利用对于我国的可持续发展和农业现代化具有重要的战略意义。纤维素是木质纤维素的主要成分,普遍存在于植物细胞壁中,每年植物经光合作用产生的纤维素总量高达1011吨,是自然界最丰富的多糖物质。纤维素酶是纤维素降解过程发挥关键作用的酶组分,根据序列一致性被分为不同的糖苷水解酶家族,不同家族中的纤维素酶采取不同的空间架构和催化机制。基于结构生物信息学平台,统计分析不同糖苷水解酶家族纤维素酶的序列、空间结构和关键氨基酸,有助于我们更加深入的了解不同家族纤维素酶与底物相互作用的结构基础和催化的共性规律,可以为纤维素酶的理性设计指明方向。本文利用结构生物信息学技术平台展开了对GH5、GH7和GH12家族纤维素酶的研究,探究了底物扭曲与内切纤维素酶分型的关系,分析了三个主要糖苷水解酶家族纤维素酶的结构特点和序列保守性,并对活性架构部位的关键亚位点氨基酸进行功能研究,以进一步阐明不同纤维素酶的作用机理。本文的主要内容如下:1.糖苷水解酶活性架构的结构生物信息学分析目前,根据序列相似度30%的划分原则,已经建立了135个糖苷水解酶家族,每个家族都具有各自的空间结构和催化模式。纤维素酶一般由多结构域组成,催化结构域中的活性架构区域对于底物的降解发挥关键作用,分析活性架构区域的序列与结构特征对于研究纤维素酶的作用机理具有重要意义。本文主要对于GH5、GH7和GH12家族进行了研究,发现不同家族的纤维素酶所作用的底物糖环具有明显的差异性。而且,这三个家族中纤维素酶活性架构的氨基酸使用频率具有一定的偏好性,-2亚位点氨基酸与底物糖环的相对位置和作用方式有所差异,这可能是导致三个糖苷水解酶家族纤维素酶差异性的结构基础。2.异源表达系统及重组酶的性质分析利用大肠杆菌和毕赤酵母两种异源表达系统对于内切纤维素酶TrCe15A(EGⅡ)进行了异源表达,研究发现两种系统表达的蛋白性质基本一致。大肠杆菌表达系统的选取取决于两个因素:一是PDB数据库中内切纤维素酶TrCe15A的结晶结构来源于大肠杆菌异源表达系统,二是大肠杆菌表达系统具有易操作、周期短的特点,这种体系可以快速获得大量的突变体蛋白,提高突变实验的效率,为纤维素酶的研究奠定了基础。3. TrCel5A酶分子活性架构关键亚位点功能研究GH5家族TrCel5A蛋白具有内切纤维素酶活性,-2亚位点对于酶分子识别与催化底物起到重要的作用,因此,本文对于TrCel5A蛋白活性中心部位-2亚位点的关键氨基酸进行了突变分析。酶活测定发现,氨基酸不同的突变方式,导致酶活的变化幅度不同。TrCel5A蛋白-2亚位点的氨基酸主要利用苯环的疏水作用结合与催化底物,活性架构中氨基酸与底物糖环之间结合力的改变导致产物谱中糖比例发生明显变化。4.TrCel7B酶分子活性架构关键亚位点功能研究GH7家族是最大的真菌糖苷水解酶家族,TrCel7B蛋白活性架构-2亚位点的保守氨基酸,与底物糖环的C2和C3位上的羟基形成氢键,对纤维素底物的结合与催化起着非常关键的作用。活性架构中同一位点的不同氨基酸可能发挥特定的功能,R108和S318这2个氨基酸在蛋白中可能起到结合底物和稳定酶-底物过渡态的作用,而Y146则可能发挥着诱导底物扭曲状态的形成。三个氨基酸的突变显示酶解产物谱发生了变化,糖的种类增多,比例发生了变化,这在商业上具有一定的应用价值。