猪伪狂犬病在欧美一些发达国家已经根除,在中国,目前只能通过疫苗接种进行预防。自2011年末以来,华北大部分地区的已接种疫苗的猪场爆发了伪狂犬病,造成了严重的经济损失,而且,爆发伪狂犬病时没有有效的药物治疗该种疾病,因此,研制有效的治疗药物对于控制猪伪狂犬病的蔓延至关重要。特异性卵黄抗体(IgY)在控制传染性的细菌或病毒疾病方面正受到大量的关注,相对于哺乳动物的IgG,IgY具有廉价、方便、高产和生物安全性好等优势,但是,目前国内外并没有应用抗猪伪狂犬病IgY的报道。本课题旨在通过制备伪狂犬病毒(PRV)灭活疫苗免疫蛋鸡来得到较高水平的抗PRV的卵黄抗体,并对制备的IgY进行体内外效果的研究,为今后抗PRV卵黄抗体用于猪伪狂犬病的治疗上提供科学依据。本课题主要研究内容如下:1抗猪伪狂犬病毒(PRV)卵黄抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立选取24只40周龄健康的产蛋鸡(三黄鸡),随机分成3组(A,B,C组),每组8只。用制备的灭活疫苗免疫3组鸡群,免疫方案为:A组注射生理盐水,B组使用灭活的PRV Bartha-K61疫苗株与白油佐剂乳化后免疫鸡群,C组使用灭活的PRV Bartha-K61疫苗株与弗氏佐剂乳化后免疫鸡群。首免后间隔4周后进行第二次免疫,二免后间隔2周进行第三次免疫,共免疫3次,3次免疫接种量分别为1mL,2mL,3mL。收集免疫鸡群的鸡蛋,无菌分离蛋黄,采用水稀释、盐析和超滤法方法从蛋黄中提取和纯化IgY,SDS-PAGE检测IgY。用全病毒包被酶标板,纯化的IgY作为一抗,建立了针对抗PRV卵黄抗体的间接ELISA检测方法,用方阵滴定法确定各反应液的工作浓度及作用时间,并对检测方法的特异性、敏感性及重复性进行了评估。用该方法检测3组免疫鸡群IgY水平。结果表明:通过分离、提取和纯化各步骤,每10mL卵黄液可以得到IgY的浓度为4.6mg/mL;抗原最佳包被浓度为1:100,酶标二抗工作浓度为1:4000,临界值为0.170-0.200,建立的间接ELISA检测方法特异性强,敏感性高,重复性好;B组和C组都得到了较高水平的IgY,从整体来看,C组得到的IgY水平比B组要高。2抗PRV卵黄抗体的体内外中和试验IgY的毒性试验:将IgY倍比稀释成不同的浓度,加入到96孔细胞培养板中,加入长势良好的PK-15细胞,在荧光显微镜下观察细胞病变(CPE)情况,结果显示:IgY不会引起PK-15细胞产生CPE,具有较好的生物安全性。IgY细胞中和试验:将IgY倍比稀释成不同的浓度,加入到96孔细胞培养板中,加入200 TCID50的PRV在37℃中和1h后,再加入长势良好的PK-15细胞继续培养,观察细胞的病变情况,并提取细胞中病毒的DNA,用荧光定量PCR测定细胞中病毒的拷贝数。结果显示:IgY对PK-15细胞的半数保护PD50为0.04,说明IgY对PRV具有较强的中和活性;当IgY的浓度为575μg/mL时,阳性对照组和IgY处理组细胞中病毒的拷贝数差异显著,并且随着IgY浓度的增加,细胞中病毒的拷贝数逐渐降低。IgY小鼠体内中和试验:将36只清洁级(Balb/c)小鼠随机分成3组,每组12只。其中,阴性对照组:每只小鼠腹股沟皮下接种0.2mL生理盐水;阳性对照组:每只小鼠腹股沟皮下接种0.2mL PRV LA病毒株(TCID50为107);试验组:将浓缩后的IgY(25.8mg/mL)与PRV病毒在37℃中和1h后,腹股沟皮下接种小鼠,0.2mL/只。于小鼠出现临床症状后采取3组小鼠血液,提取血清中DNA,用PCR检测小鼠有无发生病毒血症。当不再出现小鼠死亡后,分析小鼠的存活情况。剖杀所有小鼠,采集小鼠脑、肝脏、脾脏和肾脏,用PCR检测组织中的病毒。IgY小鼠体内中和试验表明:抗PRVIgY能为小鼠提供80%的保护率(8/10),能有效地抑制小鼠组织中PRV的增殖。