论文部分内容阅读
研究背景和目的:动脉血栓形成（arterial thrombosis）是引起心肌梗死（MI）和卒中的主要原因,是全球心血管事件死亡和致残的主要负担。抗血栓治疗是主要的预防和治疗方法,但有出血并发症的固有风险。炎症和血栓形成是紧密联系的过程,通过一种称为“免疫血栓形成（immunothrombosis）”的宿主防御效应机制来遏制病原体。免疫血栓形成的失调,可能是血栓性疾病发生发展的一个关键事件,包括心肌梗死和中风。目前的抗血栓药物不能完全预防血栓事件,这意味着可能的的治疗缺口是由于一个尚未充分阐明机制的因素--炎症。炎症最初的定义是对病原体的免疫反应。中性粒细胞是免疫系统中第一个迁移到炎症局部,并形成由瓜氨酸化组蛋白和大量颗粒蛋白装饰,以捕获细菌病原体的细胞外染色质网,即中性粒细胞细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）。最近大量的证据表明,NETs在血栓形成中起着重要作用,例如,为血小板和红细胞提供支架,辅助激活凝血因子Ⅻ,稳定纤维蛋白网等,NETs是炎症和血栓形成之间的重要联系。目前有一些以NETs为靶点抗血栓治疗的报道,显示其血栓负荷减少。DNA酶（DNase）,和氯脒（chloroamidine,peptidylarginine deiminase 4（PAD4）抑制剂）,是目前靶向NETs的主要研究点。然而,NETs中的组蛋白和中性粒细胞弹性酶（neutrophil elastase,NE）在DNase消化后仍然存在,仍可促进血栓形成。PAD4的抑制作用可能会减弱NETs介导的抗菌固有免疫,而且PAD4在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate（NADPH）oxidase）依赖的 NETs 形成过程中并非不可或缺。各种诱因,如细胞因子、细菌成分、实验性激动剂:phorbo112-myristate-13-acetate（PMA）或活化的血小板,都能刺激中性粒细胞的激活,从而导致NETs释放到细胞外。最初在血栓形成中触发NETosis的启动子可能是靶向NETs的新选择。然而,在动脉血栓形成过程中,NETotic过程是如何启动和维持的仍然不完全了解。多项研究表明,补体C5a与血栓形成密切相关。在体外,冠状动脉血栓源性血浆中补体C5a增强中性粒细胞趋化性。在体内,中性粒细胞聚集在血栓形成的部位,并与C5a和梗死面积相关。在深静脉血栓形成（DVT）模型中,C5a缺陷小鼠的血栓稳定性和负荷均降低。在败血症中,C5a刺激中性粒细胞产生NETs。C5a是否激活中性粒细胞产生NETs从而促进血栓发生发展的主要分子尚未得到证实。因此,本研究旨在探讨C5a和NETs在动脉血栓形成中的关系,为抗血栓治疗提供新思路。研究方法:1、收集心绞痛和ST段抬高型心肌梗死（ST-elevation myocardial infarction,STEMI）病人血样,构建氯化铁（Ferric chloride,FeCl3）诱导的 C57小鼠左颈总动脉血栓模型,收集假手术组和模型组小鼠血样和颈动脉血栓标本,用ELISA法分别测定其血浆C5a浓度,用免疫荧光方法检测颈动脉血栓中NETs的表达情况。2、用C5aR1特异性受体拮抗剂—PMX53腹腔注射处理FeC13诱导的C57小鼠左颈总动脉血栓,以NaCl腹腔注射作为对照组,4-6小时后利用动物多普勒超声仪进行左颈内动脉血流速度测定,收集左颈总动脉血栓标本,进行称重,之后进行HE染色和免疫荧光检测。提取小鼠骨髓中性粒细胞,加入重组小鼠C5a、C5a+PMX53,分别用免疫荧光法和多功能酶标仪荧光强度读数检测体外NETs的表达情况。3、体外培养小鼠骨髓中性粒细胞,分别加入重组小鼠C5a、重组小鼠C5a+MitoMETPO,用MitoROS检测活细胞中线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）的表达情况;分别用免疫荧光法和多功能酶标仪荧光强度读数检测体外NETs的表达情况。4、体外培养人HL-60细胞系,加入重组人C5a,收集细胞,提取线粒体蛋白,Western Blot 法检测线粒体 p-STAT3（Signal Transducers and Activators of Transcription family 3,STAT3）（Ser727）、总 STAT3、VDAC（voltage-dependentanionchannels）蛋白的表达。体外培养小鼠骨髓中性粒细胞,加入STAT3抑制剂—AG490,分别用免疫荧光法和多功能酶标仪荧光强度读数检测体外NETs的表达情况。5、分别用PMX53、PMX53+AG490腹腔注射处理FeC13诱导的C57小鼠左颈总动脉血栓,以NaCl腹腔注射作为对照组,4-6小时后利用动物多普勒超声仪进行左颈内动脉血流速度测定,收集左颈总动脉血栓标本,进行称重,之后进行HE染色和免疫荧光检测。6、体外培养小鼠骨髓中性粒细胞,分别加入重组小鼠C5a、C5a+Colivelin（STAT3激动剂）,分别用免疫荧光法和多功能酶标仪荧光强度读数检测体外NETs的表达情况。结果:1、血浆C5a和血栓中NETs表达情况:STEMI病人血浆C5a较心绞痛病人升高,FeCl3诱导动脉血栓模型组C5a和NETs均较假手术组升高。2、PMX53处理组较NaCl对照组减少了动脉血栓面积和重量,保留了更多颈内动脉血流量,同时也减少了血栓中NETs的表达量。体外实验证实C5a可刺激中性粒细胞产生NETs。3、C5a可刺激升高中性粒细胞线粒体ROS,抑制线粒体ROS的生成可抑制NETs的产生,说明C5a刺激中性粒细胞产生NETs依赖于线粒体ROS。4、C5a可刺激降低中性粒细胞线粒体p-STAT3（Ser727）/总STAT3比值,药物抑制线粒体STAT3的活性,可促进NETs的产生。5、体内利用AG490阻断线粒体STAT3活性,可逆转PMX53减轻血栓面积、重量以及保留颈内动脉血流量作用。6、体外利用Colivelin激活STAT3可逆转C5a升高线粒体ROS和刺激中性粒细胞产生NETs的作用。结论:在STEMI患者中,血浆C5a水平升高;C5a可刺激中性粒细胞产生NETs,从促进血栓的发生发展。C5a通过抑制线粒体STAT3磷酸化水平,提高线粒体ROS的产生,从而促进中性粒细胞产生NETs。本研究为抗血栓药物的研究提供了可能的新靶点。