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背景和意义在肝移植手术过程中,从供肝的切取、修整、直到移植肝脏血液再通,肝脏势必会经历一系列的缺血再灌注损伤。学者们先前的研究提示,低氧预处理可给予大脑组织保护。随后的研究也显示这一内源性保护机制同样出现在肝脏和肾脏组织中。在肿瘤细胞中,低氧诱导因子-1α在低氧条件下起了非常重要的作用,低氧诱导因子-1α是重要的转录因子来介导细胞低氧反应。为了减少在需氧代谢中活性氧对细胞DNA的损伤,由低氧诱导因子-1α调整介导的糖酵解转录可使肿瘤细胞适应低氧环境。学者们先前的研究发现低氧诱导因子-1α可以减轻大鼠肝移植模型中的缺血再灌注损伤的发生。研究显示低氧预处理可充分激活B淋巴细胞-2(Bcl-2)信号通路,从而上调Bcl-2蛋白,Bcl-2蛋白作为一种可以抑制凋亡的调节因子,通过调整线粒体的结构来调节凋亡的发生。其他的研究发现：低氧诱导因子-1α作为一个主要的转录因子,调节糖酵解和肿瘤细胞的糖代谢。低氧诱导因子-1α对糖代谢相关酶以及肿瘤细胞在有氧和低氧环境下的乳酸化合成也有影响。己糖激酶(HK)通过产生果糖-6-磷酸来影响葡萄糖的变化,其可在糖酵解过程中,通过磷酸戊糖途径进入糖酵解来产生能量(PPP),期间产生的NADPH和合成的中间体转换为糖原进行储存,而HK-2在促进合成代谢途径方面起关键得作用,且在癌症中高表达。本实验,我们通过低氧预处理来促进大鼠肝脏组织低氧诱导因子-1a的表达,并且检测糖代谢的变化,同时检测NF-κB和细胞外调节蛋白激酶(ErK)通路.意在表明低氧诱导因子-1α通过促进己糖激酶2(HK-2)和葡萄糖转运蛋白1(Glut-1)表达从而减轻肝脏炎症及原位肝移植后的缺血再灌注损伤。第一部分低氧预适应处理对肝移植大鼠肝细胞HIF-1α表达的影响目的本实验对大鼠行低氧预适应(Hypoxia preconditioning HP)处理,随后进行自体原位肝移植,探讨低氧预适应肝移植大鼠术后低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1α, HIF-1α)表达情况。方法1.清洁近交系Sprague Dawley纯系雌性大鼠被随机分为3组：低氧预处理自体原位肝移植组(HP组n=36)：供体术前行低氧预处理(氮氧混合气体,流量5 L/min,含8%氧气,共处理90分钟),8小时后行大鼠自体肝移植；大鼠自体肝移植组(AT组n=36)：大鼠行自体原位肝移植；正常大鼠对照组(Ctrl组n=16)。2.各组大鼠切取肝中叶,用RT-PCR技术检测肝脏组织HIF-1α mRNA表达的变化结果,Western blot检测HIF-1α蛋白表达变化结果。结果1. HIF-1α mRNA表达结果：为了检验低氧欲处理是否可以增加大鼠肝脏组织低氧诱导因子-1α的表达,大鼠在低氧环境中接受90分钟低氧预处理。治疗后12小时,肝组织中低氧诱导因子-1α显著增加(HP vs. Ctrl, P< 0.001)。相比于对照组,在术后12小时,肝组织中低氧诱导因子-1α的表达仍持续增高(HP vs. AT, P< 0.001).同时,在AT组,我们观测到低氧诱导因子-1α也会增高,只是其增高水平不及HP组(ATvs. Ctrl, P= 0.0597).2. HIF-1α蛋白表达结果：在蛋白水平,术后24小时HP组HIF-1α在肝组织的表达较AT组和Ctrl组高。结论经过低氧预适应处理大鼠自体肝移植术后,大鼠肝脏组织HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达均增多。第二部分低氧诱导因子-1α促进缺血再灌注肝脏糖代谢保护线粒体的研究目的该实验队大鼠自体原位肝移植模型上进行,检测到低氧预处理大鼠HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达增多这一结论基础上。从而继续探讨低氧预处理是否对缺血再灌注肝脏糖代谢有影响及肝细胞线粒体是否有保护作用。方法1.清洁近交系Sprague Dawley纯系雌性大鼠被随机分为3组：低氧预处理自体原位肝移植组(HP组n=36)：供体术前行低氧预处理(氮氧混合气体,流量5 L /min,含8%氧气,共处理90分钟),8小时后行大鼠自体肝移植；大鼠自体肝移植组(AT组n=36)：大鼠行自体原位肝移植；正常大鼠对照组(Ctrl组n=16)。2.自体肝移植大鼠术后不同时间段指标及形态学变化的比较。术后三组大鼠分别切取肝右叶,通过显微镜、电镜观察三组肝细胞组织学改变及肝细胞线粒体损伤情况；抽取尾静脉血检测肝功能指标变化,检测血清中的肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和白介素6 (IL-6); RT-PCR技术检测肝脏组织葡萄糖转运蛋白-1(Glut-1)mRNA、己糖激酶-2 (Hexoki nase-2 HK-2) mRNA、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase LDH)及丙酮酸脱氢酶激酶(PDK-1)表达的变化情况。结果1.低氧预处理促使NF-kB和ErK的表达自体原位肝移植术后,我们观察到术后24小时,HP组在大鼠肝组织中,NF-kB (HP vs. AT, P= 0.0078)磷酸化和ErK(HP vs. AT, P= 0.0044)磷酸化均较AT组显著增加。2.低氧预处理后,随着低氧诱导因子的表达,肝细胞中糖代谢随之增加在我们的实验中,我们观察到术后肝组织中Glut-1 mRNA水平增高(HP vs. AT,12h and 24h, P< 0.001)。 HK-2 mRNA水平也增高(HP vs.AT,24h,P= 0.004)。术后24小时乳酸脱氢酶(LDH) mRNA水平显著增高(HP vs. AT,24 h,P= 0.003;48 h,P=0.031.)。HP组术后丙酮酸脱氢酶激酶(PDK-I)术后显著增高(HPvs.AT, 24 h,P:0.007；48 h,P=0.001).术后24小时HP组肝组织裂解液Glut.1表达明显高于AT组(HP vs.AT,P=0.0476),HK-2的表达也明显增高(HP vs.AT,P=0.0373)。3.低氧预处理保护肝脏、减轻肝脏缺血再灌注损伤我们通过透射电镜观察肝细胞线粒体形态学变化(46000X)。HP组较AT线粒体形态上更少肿胀。电镜下,我们可以看到嵴断裂,但仍有少部分排列尚好。内质网结构尚存。而AT组,线粒体显现出不同大小,有些甚至明显松解,发生空泡变性,可见嵴的减少,因被不同程度的破坏或者消失。我们观察线粒体复合体,发现在AT组复合体1由于被破坏而低表达；HP组和对照组相比,复合体1没有明显变化。通过TUNEL分析我们发现AT组在术后12小时肝脏组织发现更多的凋亡。在肝细胞裂解液中,术后12小时Caspase-3AT组明显高于HP组(HPvs.AT,P=0.0119),同样PARP在AT组也明显增高(HP vs.AT,P=0.0134).4.大鼠模型中肝脏功能及炎症的变化为了证实缺氧欲处理是否可保护肝脏免受缺血再灌注损伤,我们检测了大鼠血清中ALT和AST.HP组血清中ALT和AST轻度升高,AT组,ALT和AST升高明显,两组比较,具有显著性差异(ALT:HP vs.AT,6 h,P:O.003；12 h,P=0.001； AST:HPvs.AT,12 h,P=0.002；24 h,P=0.006).我们检测血清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6),发现HP组由于更低的肿瘤坏死因子-α[(TNF-α)和白介素-6(IL-6)表达而表现出更轻的炎症反应(TNF-α:HP vs.At 48 h,P= 0.0008；IL-6:HP vs.AT.48 h,P=0.0213)；同样通过PT.PCR检测从mRNA水平证实HP组术后48小时肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)明显低于AT组(TNF-0[:HP vs.AT,48 h,P:0.005；IL-6:HP vs.AT,48 h,P=0.016).结论经历低氧预适应处理大鼠行自体肝移植术后,HIF-1α的表达可保护移植肝细胞组织形态,促进肝细胞糖代谢,保护肝细胞线粒体功能。