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复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是导致不孕的妊娠并发症,严重危害育龄妇女的身心健康和家庭和谐,是全世界共同关注的疑难病症。导致RSA的原因复杂,免疫学异常是导致RSA的重要原因之一。妊娠时,人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)存在于胎儿绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblasts,EVTs),可以与母体的淋巴细胞产生结合,这些淋巴细胞则聚集在蜕膜组织,而这些在母胎界面的特殊结合对于维持正常妊娠起到了重要作用。其中HLA-G在妊娠时可以引起免疫耐受,因此在维持妊娠过程中的作用尤为重要,已研究表明HLA-G低表达与RSA密切相关。妊娠早期,CD56bright自然杀伤细胞(nature killer cells,NK cells)大量聚集在母体的蜕膜组织中可以直接与胎儿的EVT接触,有许多的研究证实这群NK细胞对妊娠起重要作用,主要通过促进EVT向母体侵袭、促进子宫血管形成及螺旋动脉重塑、促进免疫耐受三方面维持正常妊娠。但是目前对这群NK细胞的调节还尚不清楚,由于这群NK细胞表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(Killer immunoglobulin-like receptor 2DL4,KIR2DL4),而KIR2DL4是HLA-G的受体,表明NK细胞表达的KIR2DL4受体也许可以通过识别HLA-G参与妊娠的维持。我们课题组前期对25-30岁孕7周发生的核型正常的自发流产以及人工流产的患者绒毛组织进行了miRNA微阵列分析,发现在两者中存在多个差异表达的miRNA,初步筛选出了与HLA-G表达相关的miRNA分子:miR-133a。并且通过实验证实了miR-133a在RSA流产绒毛高表达,miR-133a通过作用于HLA-G的3’非编码区负调控HLA-G的表达。因此,本研究在课题组前期研究的基础上,探讨mi R-133a负调控HLA-G的表达是否可以影响蜕膜NK细胞功能,进而引起流产及可能的机制,为RSA的治疗提供理论依据及潜在靶点。本研究结果分为三个部分:第一部分,蜕膜NK细胞与复发性流产相关性的研究。目的:探究蜕膜NK细胞数量或功能异常是否与RSA相关。方法:首先通过密度梯度离心法分离RSA患者和正常妊娠行人工流产患者的蜕膜淋巴细胞,用流式细胞术检测CD56+dNK细胞占蜕膜淋巴细胞的百分比以及HLA-G的受体KIR2DL4表达情况。随后,分选纯化出两组的dNK细胞体外培养24小时,用多因子检测试剂盒检测dNK细胞分泌细胞因子的能力变化,并将收集的细胞上清液用于Transwell侵袭实验和脐静脉内皮细胞HUVECs的血管形成实验。结果:RSA患者dNK细胞表达KIR2DL4受体较人工流产患者显著下调(P<0.05)。RSA患者dNK细胞分泌IP-10、VEGF显著降低(P<0.05),这两种细胞因子前者为促侵袭因子,后者为促血管形成因子。RSA患者dNK细胞分泌的细胞因子使HTR-8/SVneo细胞侵袭能力显著减弱(P<0.05),使HUVECs血管生成能力显著减弱(P<0.05)。第二部分,HTR-8/SVneo细胞系转染miR-133a及转染后HLA-G的表达。目的:在HTR-8/SVneo细胞系验证miR-133a是否负调控HLA-G的表达。方法:用脂质体向HTR-8/SVneo细胞转染miR-133a,分为三组:对照组(转染无义序列),过表达组(转染miR-133a mimics),抑制表达组(转染miR-133a inhibitor);用Western-bolt检测各组转染后HLA-G的蛋白表达情况。结果:转染了miR-133a inhibitor的HTR-8/SVneo细胞高表达HLA-G(P<0.05),转染了miR-133a mimics的HTR-8/SVneo细胞低表达HLA-G(P<0.05)。第三部分,miR-133a通过蜕膜NK细胞对滋养层细胞系功能及内皮细胞功能的影响。目的:探究miR-133a通过HLA-G是否影响dNK细胞功能进而影响妊娠。方法:在此建立两种共培养体系,一种为将转染miR-133a的人滋养层细胞系HTR-8/SVneo与分离纯化的dNK细胞共培养;另一种为将HTR-8/SVneo细胞与分离纯化的dNK细胞共培养,并加入KIR2DL4受体的抗体以封闭KIR2DL4,共培养24小时,收集两种共培养上清检测细胞因子浓度并进行Transwell侵袭实验和HUVECs成管实验。结果:共培养体系中,与转染了miR-133a mimicis的HTR-8/SVneo细胞共培养的上清IL-8、IP-10、VEGF细胞因子浓度都显著降低(P<0.05),培养上清使HTR-8/SVneo细胞侵袭能力显著减弱(P<0.05),使HUVECs血管生成能力显著减弱(P<0.05)。加入KIR2DL4抗体的共培养体系上清上述细胞因子浓度也显著降低(P<0.05),上清同样使HTR-8/SVneo细胞侵袭能力显著减弱(P<0.05),使HUVECs血管生成能力显著减弱(P<0.05)。综上所述,我们的研究表明RSA患者的dNK细胞分泌功能受损,而这种损害可能是由于miR-133a负调控HLA-G使其表达下调或受体KIR2DL4异常下调引起的。dNK细胞的分泌功能受损后,可能会影响滋养层细胞侵袭和血管形成,为深入探讨导致RSA发生的机制提供可能的理论依据以及为治疗RSA提供可能的靶点。