泌尿系结石已成为一个全球性的卫生保健问题,发病率呈逐年递增趋势,而且结石经手术治疗后复发率高。随着病程迁延反复,结石所导致的梗阻性肾病已成为慢性肾脏病进展的主要病因之一。草酸钙是泌尿系结石的主要组成成分,草酸钙结石占泌尿系结石的80%以上。然而关于肾脏草酸钙结石形成的机制目前仍不十分明确,比较公认的学说包括:肾乳头钙斑学说、尿过饱和结晶学说、抑制因素缺乏学说、免疫抑制学说、多因素学说等。这些机制研究认为多种因素参与导致的肾小管损伤可能进一步促进结晶的成核、沉积。因此,肾小管损伤可能成为研究肾结石形成一个新的方向。我们结石团队前期的研究结果提示早在草酸钙结晶形成期,既有氧化应激、细胞凋亡、自噬的参与,亦发现有肾小管上皮细胞间质转分化（epithelial mesenchymal transition EMT）的发生,这些因素相互影响可进一步导致肾间质纤维化,加重肾脏病的进展。在此基础上,本课题拟进一步研究在草酸钙结晶形成期,细胞自噬如何参与肾小管上皮细胞损伤的进程,是否可通过调控自噬活性从而抑制结晶肾损伤EMT的发生,延缓慢性梗阻性肾病的进程,为临床治疗肾结石提供新的思路和理论基础。第一部分:结晶性肾损伤模型中自噬的表达情况目的:通过对草酸钙结晶肾损伤动物模型和细胞模型中自噬相关蛋白表达情况的检测,明确自噬是否参与草酸钙结晶的形成并进一步导致肾小管损伤。方法:1.利用乙醛酸盐连续腹腔注射一周构建小鼠结晶性肾损伤动物模型,于第8天处死小鼠,应用HE染色及冯库萨染色分别观察肾组织结构变化及钙盐沉积情况,并通过免疫组化、western-blot以及免疫荧光检测小鼠肾组织中自噬关键蛋白LC3B的表达情况。2.利用一水草酸钠刺激人肾小管上皮细胞（HK2）构建草酸钙结晶肾损伤细胞模型,通过对草酸钙结晶形成时间的观察,设置时间梯度为6h、12h、24h、48h、72h,一水草酸钠浓度梯度为0m M、0.5m M、1m M、2m M,首先利用CCK8试剂盒检测HK2细胞活性,其次利用western-bolt检测不同实验条件下自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1、ATG5的表达情况。结果:1.通过HE染色后可见,与正常对照组相比,乙醛酸盐建模组小鼠近端肾小管管腔肿胀,肾小管上皮细胞脱落;冯库萨染色可见建模组小鼠肾脏组织皮髓质交界处大量钙盐沉积。2.通过肾脏组织免疫组化染色以及免疫荧光显示:与空白对照组相比,建模组小鼠肾脏组织中LC3B表达量普遍较高。3.小鼠肾组织Westernblot结果显示模型组LC3B、Beclin-1表达量显著高于对照组。4.在一水草酸钠构建的HK2细胞结晶模型中,细胞活性随着一水草酸钠浓度的升高和/或刺激时间的延长而逐渐降低,在48h时细胞活性显著降低;而自噬相关蛋白的表达随着时间延长而升高,在作用24h时表达量最高,随后逐渐降低。结论:体内外实验均证实,早在草酸钙结晶形成期,自噬已经开始过度激活,参与并进一步影响了肾结石的发生发展。第二部分:草酸钙结晶肾损伤模型中EMT发生情况以及自噬活性对EMT的影响目的:验证早在肾结石形成早期—草酸钙结晶期已经出现肾小管上皮细胞间质转分化EMT,并且自噬参与了肾小管上皮EMT的进程,通过调控自噬活性可改善肾小管上皮细胞的损伤,并延缓草酸钙结晶肾损伤期EMT的发展。方法:1.取对照组与模型组小鼠肾脏组织通过免疫组化、western-blot检测各组小鼠肾组织中EMT相关蛋白以及自噬相关蛋白的表达情况;2.按照一水草酸钠刺激HK2细胞株的时间梯度进行分组,利用western-blot检测EMT相关蛋白的表达情况;然后加予自噬抑制剂以及自噬激动剂进一步将细胞进行分组:空白对照组、一水草酸钠建模组、模型+3MA组、模型+雷帕霉素组,通过wester-blot检测自噬相关蛋白LC3B、以及EMT相关蛋白的表达情况。结果:1.动物实验结果显示:与空白对照组相比,模型组小鼠肾脏组织中Ecadherin表达显著下调,而vimentin以及LC3B表达显著上调2.体外细胞实验结果显示:与空白对照组相比,实验组细胞随着一水草酸钠刺激时间的递增,上皮标志Ecadherin表达逐渐下调,而间皮标志α-SMA、Vimentin表达逐渐上调,在24h时趋势最显著;加入自噬抑制剂3MA后,自噬相关蛋白表达水平显著下降,同时间皮标志α-SMA、vimentin表达也显著下调而上皮标志E-cadherin表达显著回调;草酸钠+雷帕霉素组自噬相关蛋白LC3B表达上调,同时间皮标志α-SMA、vimentin表达上调,而上皮标志E-cadherin表达进一步下调。结论:通过体内外实验研究发现,草酸钙刺激可启动肾小管上皮细胞间质转分化（EMT）的进程,并且发现,EMT关键蛋白表达水平变化与自噬关键蛋白表达一致,通过调控自噬活性,发现EMT相关蛋白表达趋势与自噬表达趋势一致,因此推测草酸钙可诱导自噬过度激活从而促进了结晶肾损伤肾小管上皮细胞EMT发生发展。第三部分:草酸钙诱导的肾小管上皮细胞自噬调控结晶肾损伤EMT的机制研究目的:探讨自噬活性变化调控草酸钙结晶肾损伤EMT的潜在可能机制方法:我们提取对照组和乙醛酸盐造模组小鼠肾脏组织蛋白通过western-blot检测两组小鼠肾组织中p-m TOR、p-smad3的蛋白表达水平,以及四组细胞（对照组、草酸钠结晶组、3MA+草酸钠结晶组、雷帕霉素+草酸钠结晶组）中p-m TOR、psmad3的蛋白水平。结果:细胞实验以及动物实验结果均提示模型组p-m TOR显著下调,而psmad3呈上调趋势;在细胞模型中给予自噬抑制剂3MA后上调了p-m TOR蛋白水平从而导致p-smad3蛋白表达下调;模型组联合雷帕霉素处理后进一步抑制了pm TOR活性,导致p-smad3表达进一步上调。结论:草酸钙晶体刺激肾小管后抑制m TOR蛋白表达从而诱导自噬,自噬进一步通过调控smad分子通路促进肾小管EMT的发生。