糖尿病（diabetes mellitus,DM）是一种以血糖升高为特征、累积全身器官的系统代谢性疾病,2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）为其主要临床类型。除了典型的“三多一少”（多饮、多食、多尿和体重减轻）临床表现外,持续的高血糖与长期代谢紊乱还可导致T2DM患者全身组织器官功能障碍和衰竭,引起严重的并发症。近年来,T2DM的情感及认知功能障碍受到人们广泛关注,流行病学调查结果显示,与非糖尿病患者相比,T2DM患者患阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）的风险高达65%,且80%的AD患者患有T2DM或出现血糖及胰岛素水平的异常。本课题组前期研究结果表明,T2DM患者血浆糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）浓度与认知功能紧密相关,高HbA1c水平的T2DM患者存在更为严重的认知功能障碍。因而,探究T2DM患者神经精神损伤的发病机制已经成为代谢性疾病及神经性疾病领域的重要研究问题之一。褪黑素（melatonin,MLT）是一种主要由松果体合成和分泌的内源性吲哚胺类物质,除作用于生物节律外,还具有清除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗炎和免疫抑制等多种生物学活性。新近研究表明,MLT丰度及其受体表达改变在葡萄糖稳态的维持和T2DM的发生机制中起重要作用,并可能是抑郁症及AD的早期临床表现之一。与此相一致,本课题组前期研究结果表明,T2DM患者血浆MLT浓度水平降低,且与认知量表中行为管理及元认知项目得分呈负相关。为此,本项目将建立T2DM整体动物及细胞模型,系统观察MLT对T2DM的治疗作用,重点关注其对T2DM糖脂代谢、神经精神行为、突触可塑性和昼夜节律的影响。目的建立T2DM整体动物模型及细胞模型,观察MLT对T2DM糖脂代谢紊乱及神经精神损伤的治疗作用并探究其可能的作用机制。方法1.T2DM对糖脂代谢和神经精神行为的影响（1）体内实验:将C57BL/6小鼠随机分成两组,包括8只正常组和12只模型组。适应性饲养一周,采用高脂饮食（high-fat-diet,HFD）联合腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,100mg/kg）的方法建立小鼠T2DM模型,对照组小鼠给予标准对照饲料及腹腔注射等剂量溶媒。采用旷场实验（Open field test,OFT）、新物体识别实验（Novel object recognition test,NOR）、Y-迷宫实验（Y-maze test）、高架十字迷宫实验（Elevated plus maze test,EPM）、Morris 水迷宫实验（Morris water maze,MWM）、悬尾实验（Tail suspension test,TST）和强迫游泳实验（Forced swimming test,FST）观察小鼠的神经精神行为,采用口服葡萄糖耐量实验（Oral glucose tolerance test,OGTT）评估小鼠的葡萄糖耐受能力。化学发光法检测血清高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL-C）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein,LDL-C）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）和葡萄糖（glucose,Glu）浓度。酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清胰岛素（insulin,INS）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）和褪黑素（melatonin,MLT）浓度。苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE staining）观察肝脏及胰腺组织形态学变化。转录组学测序分析正常组及模型组小鼠海马中mRNA的差异化表达,并对测序结果进行GO分析KEGG富集分析。蛋白免疫印迹技术（Western Blotting,WB）和实时荧光定量PCR技术（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测小鼠海马、前额叶皮层（prefrontal cortex,PFC）和下丘脑中突触相关蛋白、BNDF/TrkB/Akt/ERK/CREB信号通路关键分子及昼夜节律相关蛋白的表达情况。（2）体外实验:体外培养HT-22小鼠海马神经元细胞,采用MTT法观察不同浓度梯度 PA（0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8 mM）及不同作用时间（6,12,24,48 H）对HT-22细胞活力的影响,确定HT-22细胞损伤模型的建立方法。油红O染色观察细胞内脂质沉积。免疫荧光染色观察细胞内Map-2表达变化。WB和qRT-PCR技术检测HT-22细胞中突触相关蛋白、BNDF/TrkB/Akt/ERK/CREB信号通路关键分子及昼夜节律相关蛋白的表达变化。2.MLT对T2DM糖脂代谢紊乱和神经精神损伤的影响（1）体内实验:将C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、MLT治疗组（5、10、20 mg/kg）,阳性对照药物Stg组（15 mg/kg）和Flu组（5 mg/kg）,每组8只。T2DM造模方法同第一部分。造模结束连续三周血糖平稳后,给药组按照上述给药剂量持续灌胃给药6周,对照组和模型组给予等体积溶媒。采用OFT、NOR、Y-maze、EPM、MWM、TST和FST行为学实验评估小鼠的神经精神行为,采用OGTT评估小鼠的葡萄糖耐受能力。化学发光法检测血清Glu、TC、TG、HDL-C和LDL-C浓度,ELISA法检测血清INS、HbA1c和MLT浓度。HE染色观察肝脏及胰腺组织学变化。WB技术检测小鼠海马、PFC和下丘脑中突触相关蛋白、BNDF/TrkB/Akt/ERK/CREB信号通路关键分子及昼夜节律相关蛋白的表达情况。（2）体外实验:体外培养HT-22细胞,设置对照组、模型组、MLT治疗组（10-6～10-8 mol/L）组、阳性对照药物Stg组（10-7 mol/L）和Flu组（10-7 mol/L）。按照上述PA作用浓度和作用时间诱导细胞损伤后,采用MTT法观察MLT干预对PA刺激细胞活力的影响,葡萄糖氧化酶法检测细胞培养上清液中葡萄糖消耗量的变化。油红O染色和免疫荧光染色观察MLT干预对细胞内脂质沉积和Map-2表达变化的影响。WB技术检测MLT干预对PA诱导的HT-22细胞中突触相关蛋白、BNDF/TrkB/Akt/ERK/CREB信号通路关键分子及昼夜节律相关蛋白的表达情况。结果1.血清MLT水平下降及其相关的昼夜节律紊乱参与T2DM糖脂代谢紊乱及神经精神损伤的发生,其机制涉及BNDF/TrkB/Akt/ERK/CREB信号通路的活性改变与对照组相比,模型组小鼠空腹血糖浓度（fasting blood glucose,FBG）及血清INS、HbA1c、TC、TG、LDL-C水平明显升高,血清HDL-C和MLT浓度降低,口服葡萄糖耐量受损,胰岛素抵抗增加,肝脏湿重及肝指数增大,肝脏组织脂肪变性,胰岛细胞严重萎缩,提示模型组小鼠出现糖脂代谢紊乱;行为学结果显示,模型组小鼠存在学习记忆障碍及焦虑抑郁样神经精神行为异常。具体表现为:与对照组相比,模型组小鼠在OFT中的总移动距离及中央移动距离、总穿线次数及进入中央频率无明显改变,在EPM中闭合臂的移动距离增加,在TST中不动时间增加、挣扎时间减少,在FST中不动时间增加、游泳时间减少,在NOR中新物体识别指数显著下降,在Y-maze中新异臂优先指数显著降低,在MWM中模型小鼠逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短,但两组间差异无统计学意义;相关分析结果表明,T2DM小鼠血清MLT浓度与INS水平、HOMA-IR及FST中的不动时间呈负相关,与NOR中的新物体识别指数呈正相关;海马转录组学测序结果显示,两组小鼠海马间差异表达的mRNA共有47个,其中包含22个表达上调的mRNA和25个表达下调的mRNA;GO和KEGG富集分析结果显示T2DM诱导差异表达的mRNA参与了包括MAPK通路、Wnt通路、mTOR通路、PI3K-Akt通路和昼夜节律通路在内的多种信号转导通路的调控;WB实验结果显示,与对照组小鼠比较,T2DM模型组小鼠海马和PFC中突触相关蛋白c-fos、Synapsin1、Synaptotagmin1、BDNF、p-TrkB、p-Akt、p-ERK 及 p-CREB 的蛋白表达均显著下降;此外,昼夜节律相关蛋白MT1A、MT1B、Bmal1、Clock、Per2及Cry2在T2DM模型组小鼠海马和PFC中表达下调,但在下丘脑中表达上调。体外实验中MTT结果显示,随着PA刺激浓度的增加及刺激时间的延长,HT-22细胞活力减弱;油红O染色与免疫荧光染色结果显示,与对照组细胞相比,PA刺激的模型组细胞脂质沉积增多,形态变化明显,综合选择0.1 mMPA刺激24H实验条件用于后续研究;WB结果显示,与对照组细胞相比,经0.1 mMPA诱导的HT-22 细胞中突触相关蛋白 c-fos、Synapsin1、Synaptotagmin1、BDNF、p-TrkB、p-Akt、p-ERK、p-CREB 及昼夜节律相关蛋白 MT1B、Bmal1、Clock、Per2和Cry2的表达均显著下调,但MT1A的表达无明显变化。以上结果提示,外周MLT水平及其调节的昼夜节律过程可能参与T2DM糖脂代谢紊乱及相关的神经精神损伤。2.外源性MLT给药可通过调节昼夜节律及BNDF/TrkB/Akt/ERK/CREB信号通路活性改善T2DM的糖脂代谢紊乱、神经精神行为异常及突触可塑性改变与T2DM模型组小鼠相比,MLT（5、10、20mg/kg）灌胃给药可显著降低小鼠的 FBG 及血清 INS、HbA1c、TC、TG、LDL-C 水平,升高 HDL-C 和 MLT水平,改善葡萄糖耐量、胰岛素抵抗及肝脏和胰腺的组织损伤,提示MLT可以改善T2DM小鼠的糖脂代谢紊乱;行为学结果表明,MLT（5、10、20mg/kg）灌胃给药后T2DM小鼠在EPM闭合臂中的移动距离及在TST和FSF中的不动时间显著减少,在NOR中的新物体识别指数及在Y-maze中的新异臂优先指数增加,在MWM定位航行实验的逃生潜伏期缩短且在空间探索实验中进入平台区域潜伏期和目标象限停留时间显著增加,且T2DM小鼠血清MLT浓度与其在MWM中的学习记忆行为显著相关,提示MLT对T2DM小鼠学习记忆障碍及焦虑抑郁样行为具有改善作用;体外实验结果显示,MLT（10-6～10-8 mol/L）干预对PA诱导的HT-22细胞活力下降,细胞脂质沉积增多,细胞葡萄糖消耗量增加及细胞形态变化具有改善作用;WB实验结果表明,MLT给药可逆转T2DM模型小鼠海马、PFC和 PA 诱导的 HT-22 细胞中突触相关蛋白 c-fos、Synapsin1、Synaptotagmin1、BDNF、p-TrkB、p-Akt、p-ERK 及 p-CREB 的表达失衡;此外,MLT（5、10、20mg/kg）灌胃给药及MLT（10-6～10-8 mol/L）体外给药可逆转T2DM模型组小鼠海马、PFC、下丘脑和PA诱导的HT-22细胞中昼夜节律相关蛋白MT1 A、MT1B、Bmal1、Clock、Per2和Cry2的表达变化。结论1.HFD联合STZ腹腔注射可成功诱导小鼠T2DM模型,具体表现为糖脂代谢紊乱、肝脏及胰腺功能受损,以及包括昼夜节律失衡、学习记忆能力减退、焦虑抑郁样行为及突触可塑性改变在内的神经精神损伤。2.MLT给药可以改善T2DM的糖脂代谢紊乱及神经精神损伤,其机制可能与调节昼夜节律、突触可塑性及BDNF/TrkB/Akt/ERK/CREB信号通路功能有关。