论文部分内容阅读
脑血栓性疾病以极高的致死率、致残率危害着人们的健康,但现行的治疗中全身给药伴随着很高的出血意外,介入治疗虽然有针对性但是存在着较高的手术风险、较高的再梗塞率和较窄的适用人群。靶向给药,通过全身给药的方式就能像介入一样在局部形成高浓度,同时回避了手术风险；因为大大降低了全身给药量又最大程度地控制了出血风险,因而具有极大的研究价值。众所周知,组织因子(tissue factor, TF)在整个凝血瀑布中扮演了扳机点的角色；而对于急性心、脑血管事件,血管损伤所释放的TF与血液中的凝血因子Ⅶ(coagulation factorⅦ, FVU)特异性结合是重要的始动因素。FⅦ与TF结合的部位主要位于类表皮因子一区(EGFl)和SP区,EGF1可以与TF特异性结合但是没有促凝血活性,因此在前期研究中我们基于大鼠FⅦ的EGF1区的结构制备了EGFP-EGF1融合蛋白,并对其与TF的结合功能做了一系列研究。研究表明将EGFP-EGF1蛋白作为靶向功能基连接在聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)纳米粒的表面,能明确靶向到TF表达部位,在体内、外试验中均得到验证。由于采用聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)制备的纳米粒比PLA纳米粒具有更高的基因转染效率,于是本研究采用PEG-PLGA作为聚合物材料制备纳米粒,以EGFP-EGF1作为靶向性头基,与之共价连接制备了新型的药物递送系统——GF1-EGFP-NP。该纳米粒以受体介导的方式增加其脑梗塞部转运,将该生物可降解的纳米粒作为药物的载体,不仅安全性好,还能显著提高药物的稳定性和输送能力；纳米粒采用复乳／溶媒蒸发法制备,适合于包载水溶性大分子药物,比如蛋白、多肽和基因药物,可以掩盖其自身的理化性质,代之以纳米粒的特性；纳米粒表面经过PEG修饰,可以避免单核巨噬系统的吞噬,延长在血浆中的半衰期,提高药时曲线下面积(Area under curve,AUC),具有长循环作用。本文第一部分为EGF1-EGFP-NP的制备与表征,它是通过复乳／溶媒蒸发法将马来酰胺亚胺封端的聚乙二醇-羟基乙酸共聚物(Maleimide-PEG-PLGA)和单甲氧基聚乙二醇乳酸-羟基乙酸共聚物(MPEG-PLGA)按照1：10的比例混合制备NP,并通过表面的Maleimide-PEG与巯基化的EGFP-EGF1蛋白共价结合而成。该纳米粒的平均粒径为100 nm左右形态圆整、规则,Zeta为-15 mV左右。免疫电镜观察结果证实纳米粒子表面共价结合有EGFP-EGF1,并计算出表面连接的蛋白数目为112±7个。为了评价EGF1-EGFP-NP的TF靶向递药特性与毒性,本文第二部分制备了高纯度的原代大鼠BCEC,用TNF-a成功复制了BCEC表达TF的细胞模型。以6-香豆素作为荧光探针,对EGF1-EGFP-NP的BCEC内递药特性进行了评价,结果表明6-香豆素在NP和EGF1-EGFP-NP中24 h内的体外渗漏率低于3.62%,能准确示踪其体内外的生物学行为。BCEC对纳米粒的摄取结果表明,异常表达TF的BCEC对EGF1-EGFP-NP的摄取存在TF与EGF1结合介导的摄取增强效应。细胞活力测定结果显示,EGF1-EGFP-NP与NP比较,其IC20和ICso均无显著性差异,证实了EGF1-EGFP-NP具有良好的生物安全性。通过以上体外实验证明,EGF1-EGFP-NP是一种具有TF介导的递药特性且毒性较低的药物传递系统。第三部分以光化学法复制的大鼠皮质微血栓模型为基础,首先以6-香豆素为荧光探针通过药动学的方法研究了EGF1-EGFP-NP的脑内递送特点。结果发现EGF1-EGFP-NP与NP相比其脑血栓部位的靶向指数为2.58；组织分布的结果表明肺脏和肾脏的分布有所增加,肝脏有所降低。通过以Dir为荧光探针进行活体与器官成像结果表明,在对应脑血栓照射部位,各时间点EGF1-EGFP-NP表现的荧光强度都高于NP,通过器官成像及定量分析发现1h、4h和24 h在脑血栓形成部位EGF1-EGFP-NP的浓度为NP的两倍以上,其中以1h时最高,为2.66倍。脑组织微观和超微水平观察结果显示,梗塞灶内的EGF1-EGFP-NP基本分布在梗塞灶的血管内,而且与局部表达的TF定位一致,这表明其有明确的TF靶向效能。通过TEM观察发现EGF1-EGFP-NP主要分布在血管内皮细胞胞浆和细胞核内,提示其能够递送药物进入损伤的脑微血管内皮细胞。急性毒性试验结果表明,高剂量的EGF1-EGFP-NP不影响大鼠的凝血功能；吞噬细胞特异性染色显示,高剂量的EGF1-EGFP-NP不引起SD大鼠脑、心脏和肝脏的急性炎症反应,仅对脾脏、肺脏和肾脏产生一过性的轻微毒性。因此,EGF1-EGFP-NP是具有一定的脑血栓靶向特性,而且毒性较低的递药系统。为了实现对脑血栓性疾病的靶向治疗,第四部分采用EGF1-EGFP-NP作为靶向输送的载体,构建了包载NFκB TFD ODNs的药物传递系统,并对其体内外效能进行了初步评价。对该纳米粒的表征结果表明,其粒径为105.5±10.02 nm；Zeta电位值为-17.23±1.49 mV；载药量为0.23%；包封率为55.75%；纳米粒的制备工艺未对ODNs的结构造成破坏。通过CY3标记的ODNs和6-香豆素作为荧光探针,比较了表达TF的BCEC对EGF1-EGFP-NP-ODNs和NP-ODNs摄取情况,结果不仅发现EGF1-EGFP-NP-ODNs的摄取明显高于NP-ODNs,而且可以明显观察到ODNs被转运入细胞核。实时定量PCR结果显示,EGF1-EGFP-NP-ODNs能明显降低TNF-a刺激的BCEC的TF mRNA的表达水平,效果明显强于ODNs和NP-ODNs;通过Western blotting结果显示,EGF1-EGFP-NP-ODNs能明显降低TNF-a刺激的BCEC的TF蛋白的表达水平,效果明显强于ODNs和NP-ODNs.通过活体和器官成像,EGF1-EGFP-NP-ODNs在脑梗塞处的浓度为NP-ODNs的4倍左右。造模结束后立即给药,6 h时与生理盐水和NP-ODNs组相比,EGF1-EGFP-NP-ODNs组的TF表达明显下降(P=0.002和P=0.023)；24 h时通过7.0T MR检测发现,EGFl-EGFP-NP-ODNs组的梗死体积也明显缩小,与生理盐水和NP-ODNs组相比差别均有统计学意义(P=0.004和P=0.015)。该研究成果表明EGF1-EGFP-NP-ODNs具有明显的靶向性干预脑血栓的效能,该研究为其他TF相关性疾病的治疗打下一定的基础。