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急性缺血性脑卒中是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。近年来,我国的急性缺血性脑卒中的发病率及死亡率仍处于持续上升阶段,给国家和社会带来了重大的疾病负担和经济压力。动脉粥样硬化病变是一个渐进性发展的过程,易引发心脑肾等病变,而急性缺血性脑卒中是动脉粥样硬化病变的严重并发症。脑卒中病因及病理过程复杂,目前认为,各种原因引起的颈动脉粥样硬化斑块的不稳定及斑块脱落,引发动脉至动脉性脑血管栓塞是最终导致急性缺血性脑血管病的重要发病机制之一。所以,如何早期识别不稳定性斑块,了解不稳定性斑块的形成机制来预防不稳定性斑块脱落,能否逆转或修复不稳定性斑块成为了预防和治疗急性缺血性脑卒中的重要靶点。第一部分TLR4在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块发生发展过程中的作用机制目的:通过Toll样受体4(TLR4)在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块发生发展过程中表达的变化,探讨TLR4在动脉粥样硬化斑块形成和发展过程中的作用机制。材料与方法:8周龄ApoE-/-小鼠20只,给予适应性喂养1周。1周后随机分组,分为对照组、普通饮食组、10周模型组和20周模型组等4组。对照组小鼠直接处死,留取组织学标本。普通饮食组给予普通饲料喂养,10周后处死。10周模型组给予高脂饮食喂养,10周后处死。20周模型组给予高脂饮食喂养,20周后处死。上述4组小鼠均采集单侧眼球血行血胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)检测。留取颈动脉及主动脉标本,分别对标本进行HE染色、油红O染色、弹力纤维染色、天狼星红染色。免疫组化方法检测颈动脉斑块巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)、Toll样受体4(TLR4)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达。结果:1.普通饮食组与对照组相比较,其TC、TG及ox-LDL水平升高(P<0.05);10周模型组与普通饮食组相比较,其TC、TG及ox-LDL水平明显升高(P<0.05),动脉粥样硬化斑块模型制作成功。2.20周模型组与10周模型组比较,其TC、TG及ox-LDL水平升高(P<0.05);20周模型组与10周模型组比较,颈动脉斑块范围大,脂质增多,巨噬细胞增多,弹力纤维损伤、断裂,胶原纤维成分减少,平滑肌细胞减少。3.20周模型组与10周模型组比较,其TLR4、IL-1β、IL-6及TNF-α的表达均较高(P<0.05)。结论:1.ApoE-/-小鼠在高脂饮食条件下可成功制作动脉粥样硬化斑块动物模型,且随高脂饮食时间延长,动脉粥样硬化斑块更加明显,不稳定性增加,高脂饮食可增加造模成功的条件,促进斑块模型成功建立。2.随小鼠动脉粥样硬化斑块模型的建立及不断进展,其TC、TG及ox-LDL水平更高,斑块面积扩大,巨噬细胞增多,胶原纤维成分减少,平滑肌细胞减少,斑块的不稳定性增加。3.小鼠动脉粥样硬化性斑块形成后,随着斑块的不断进展,其TLR4及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达增加,进而促进斑块不稳定性,参与不稳定性斑块的发生发展。第二部分TLR4介导内质网应激对小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响目的:通过观察TLR4诱导内质网应激通路蛋白表达水平的变化,来探讨TLR4介导的内质网应激对小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。材料与方法:8周龄ApoE-/-小鼠24只。适应性喂养1周后给予高脂饮食喂养10周。10周后分组,分为对照组、LPS组、TAK组,每组8只小鼠。对照组每周2次给予生理盐水腹腔注射;LPS组每周2次给予LPS(1mg/kg)腹腔注射;TAK组每周2次给予TAK-242(0.3mg/kg)腹腔注射。干预10周后取眼球血检测TC、TG、ox-LDL。留取颈动脉及主动脉标本,观察动脉粥样硬化斑块情况。分别对标本进行HE染色、油红O染色、弹力纤维染色、天狼星红染色。免疫组化方法检测颈动脉斑块巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)、Toll样受体4(TLR4)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及核因子κB(NF-κB)的表达。Western Blot检测PERK、CHOP、GRP78的水平。结果:1.与对照组和TAK组比较,LPS组TC、TG、ox-LDL水平升高(P<0.05);TAK组TG、ox-LDL水平较对照组降低(P<0.05)。2.与对照组和TAK组比较,LPS组小鼠动脉粥样硬化斑块范围大,巨噬细胞含量增多(P<0.05),平滑肌细胞含量减少(P<0.05);与对照组比较,TAK组小鼠动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞含量减少(P<0.05),平滑肌细胞含量增多(P<0.05)。3.与对照组和TAK组比较,LPS组小鼠斑块TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α及NF-κB的表达增加(P<0.05);与对照组比较,TAK组TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α及NF-κB的表达减少(P<0.05)。4.与对照组和TAK组比较,LPS组PERK、CHOP、GRP78的表达水平增加(P<0.05);与对照组比较,TAK组PERK、CHOP、GRP78的表达水平减少(P<0.05)。结论:1.TLR4水平增加诱导内质网应激下游炎性因子分泌增加,脂质代谢紊乱加重,促使动脉硬化斑块不稳定性增加。2.LPS可上调TLR4及内质网应激通路蛋白的表达,而TAK-242作为LPS拮抗剂下调TLR4及内质网应激通路蛋白的表达。3.TAK-242通过下调TLR4及内质网应激通路蛋白的表达,使巨噬细胞减少,平滑肌含量增加,减轻动脉硬化斑块不稳定性。第三部分阿托伐他汀及联合普罗布考对TLR4介导内质网应激的影响目的:观察阿托伐他汀及联合普罗布考对TLR4介导内质网应激的影响,探讨其在小鼠动脉粥样硬化不稳定性斑块修复中的作用及其抗动脉粥样硬化的作用机制。材料与方法:8周龄ApoE-/-小鼠30只,适应性喂养1周。1周后给予高脂饮食喂养10周。10周随机分组:分别为对照组、他汀组、联合组等3组。对照组每日给予超纯水灌胃10周;他汀组每日给予阿托伐他汀(10mg/kg/d)灌胃10周;联合组每日给予含普罗布考的高脂饲料喂养,并每日给予阿托伐他汀(10mg/kg/d)灌胃10周。干预结束后取单侧眼球血检测血清TC、TG、ox-LDL水平。留取颈动脉及主动脉标本观察斑块大体情况。对斑块组织进行HE染色、油红O染色、弹力纤维染色、天狼猩红染色。免疫组化方法检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)、Toll样受体4(TLR4)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及核因子κB(NF-κB)的表达。Western Blot检测PERK、CHOP、GRP78的水平。结果:1.与对照组比较,他汀组及联合组TC、TG、ox-LDL水平降低;与他汀组比较,联合组ox-LDL水平降低(P<0.05)。2.与对照组比较,他汀组及联合组斑块内弹力纤维断裂少,脂质含量减少,胶原含量增多(P<0.05);与他汀组比较,联合组斑块面积缩小,斑块内巨噬细胞含量减少(P<0.05)。3.与对照组比较,他汀组及联合组小鼠斑块IL-1β、IL-6、TNF-α的表达减少(P<0.05);且他汀组及联合组TLR4表达减少,NF-κB的表达减少。4.与对照组比较,他汀组及联合组其PERK、CHOP、GRP78的水平表达减少(P<0.05),但他汀组与联合组比较无显著性差异。结论:1.阿托伐他汀可通过降低TLR4表达水平,降低内质网应激反应,减轻下游炎症因子的表达,增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。2.普罗布考与阿托伐他汀联合应用较单独应用阿托伐他汀,可进一步减小斑块面积,修复动脉粥样硬化斑块作用更显著。