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外来病源微生物(如细菌、病毒和寄生虫等)入侵机体粘膜可造成呼吸道、消化道或全身性的疾病。粘膜免疫是在病原微生物入侵部位诱导局部长期免疫记忆的最有效方法,它是机体阻止病原微生物入侵的第一道防线。在粘膜免疫的几种途径中,鼻腔粘膜途径最具非常大的潜力,它不仅可以诱导鼻腔局部免疫还能诱导远端粘膜部位的免疫反应。纳米载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。纳米载体的特点使其成为优良的粘膜疫苗佐剂。第一,纳米载体能够控制抗原的释放,使抗原在粘膜部位停留时间大大增长；第二,纳米载体能够整合其抗原递呈的功能和其他的效应,如免疫调节和免疫刺激作用；第三,纳米载体能够克服粘膜生理屏障,有效地增加抗原到达免疫系统的数量。本文根据DNA疫苗和蛋白质疫苗的特点,分别设计了两种纳米载体来提高疫苗的免疫应答效果。所使用的疫苗为针对龋病致病菌(变形链球菌)的DNA疫苗,以及蛋白模型疫苗OVA(卵清蛋白)。首先,由于各种生理屏障的存在,防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX单独作为粘膜疫苗使用时,免疫保护效果有待改进。通过将阴离子脂质体(AL)引入壳聚糖(CS)纳米载体,我们设计了一种新的DNA疫苗粘膜免疫载体AL/CS/DNA。它能够将DNA疫苗运送至鼻腔粘膜层中,具有增强抗原在上皮细胞内吞的功能。TEM的结果显示AL/CS/DNA是一种球形结构,它具有很高的包封率,而且能够抵抗核酸酶的降解从而保护DNA疫苗结构和功能上的完整性。AL/CS/DNA的表面电荷具有强烈的pH环境依赖性,造成了DNA释放由环境pH介导。和传统的CS/DNA复合物相比,AL/CS/DNA拥有更高的转染效率和更长的鼻腔停留时间。这些特性使得AL/CS/DNA能够显著诱导更高水平的IgA (p<0.01)以及长效粘膜免疫力,提示AL/CS/DNA是一种非常有潜力的DNA疫苗粘膜给药载体。其次,聚乳酸羟基乙酸(PLGA)纳米囊是一种有潜力的蛋白质疫苗载体,用于粘膜免疫时能够显著增强免疫应答,同时具有良好的生物降解性和生物相容性。然而PLGA纳米囊惰性的、负电荷表面限制了其与负电荷细胞膜之间的相互作用,定程度上限制了细胞对它的摄取。本研究采用乙二醇壳聚糖(GC)对PLGA纳米囊表面进行修饰,来增强其粘膜免疫应答的效果。GC的作用主要体现在几个方面：是增强树突状细胞(DC细胞)对纳米囊的内吞；二是可以与溶酶体相互作用来促进纳米囊从溶酶体中逃逸；三是延长抗原在鼻腔粘膜的停留时间。这些优势使得OVA/PLGA/GC (OPG)纳米囊能够诱导有效的粘膜免疫应答、系统性免疫应答和细胞免疫应答。本研究完成的主要工作有：(1)利用自组装的方法制备了AL/CS/DNA复合物。通过体外细胞转染实验证实N/P比为7、lipid/DNA比为3时可以得到较高的转染效率。所得的AL/CS/DNA复合物纳米粒为球形,结构规整。(2)凝胶阻滞法和圆二色谱法证实了AL/CS/DNA复合物能够有效地压缩DNA,但不影响DNA的B型构象。同时AL/CS/DNA复合物对环境pH变化敏感,DNA的释放具有pH依赖性。(3)体内荧光成像法证实了AL/CS/DNA比CS/DNA具有更长的鼻腔停留时间、更好的穿透粘膜层的能力。AL加入并不影响CS/DNA复合物对粘液素蛋白吸附能力和打开细胞连接的能力,而是通过增强上皮细胞对AL/CS/DNA的摄取来延长复合物的鼻腔停留时间。(4)与CS/DNA相比,AL/CS/DNA通过鼻腔粘膜途径能够显著诱导唾液IgA应答,且持续时间维持12周以上。AL/CS/DNA能够同时在近端粘膜和远端粘膜系统产生粘膜应答,有潜力作为诱导全身性粘膜免疫应答的载体。(5)利用复乳溶剂挥发法制备了OP (OVA/PLGA)和OPG (OVA/PLGA/GC)纳米囊。制得的OP和OPG纳米囊均为球形结构且形态规整,OPG有明显的核壳型结构。(6)细胞摄取和共定位成像实验证实了GC对PLGA纳米囊的表面修饰可以进一步提高DC细胞对PLGA纳米囊的摄取,而对PLGA纳米粒在细胞内的分布没有影响。OP和OPG纳米囊两者都没有进入到细胞核中,且两者都具有从溶酶体中逃逸的能力。(7)体内实时荧光成像法证实了GC对PLGA纳米囊的表面修饰可以大大延长抗原在鼻腔中的停留时间,一方面是由于细胞对两者摄取的效率不同,更多的OPG进入到了细胞中；二是OP和OPG纳米囊的粘附性不同,OPG纳米囊在鼻腔粘膜拥有更广的分布。但是两者都具有粘膜穿透能力,都进入到了粘膜层中,而OVA只是停留于粘膜层外。(8)本研究对OP和OPG纳米囊在诱导粘膜免疫、系统性免疫和细胞免疫的能力进行了评价,结果证实经鼻腔给药的OPG显示出一定的诱导血清IgG的能力,以及同时诱导近端粘膜系统和远端粘膜系统应答的能力。另外,OPG还能诱导Thl型的细胞免疫应答。这些结果表明GC的表面修饰对于PLGA纳米囊在鼻腔中产生的免疫具有多重增强作用。这些结果显示AL/CS/DNA纳米粒和OPG纳米囊作为粘膜疫苗载药系统,可以有效地增强DNA疫苗和蛋白质疫苗的免疫应答,有潜力成为新型的鼻腔粘膜疫苗载体。