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间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是成体干细胞的一种,具有免疫调节功能和分化潜能,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、韧带、基质和肌腱等多种中胚层组织。作为MSCs的一种,人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)同样具有组织修复功能,并且来源广泛,取材方便,增殖、分化能力较强,免疫原性低,不表达HLA-Ⅱ型表面抗原,不产生畸胎瘤等特点。为了分离、培养hUC-MSCs,并探讨体外培养过程中表观遗传学的改变,本实验随机选取足月顺产健康胎儿脐带,采取手工机械分离+酶组合消化法从脐带胶质中释放人脐带间充质细胞。使用MTT法检测hUC-MSCs生长增殖活性。流式细胞术检测细胞表面标志物。分化培养基诱导hUC-MSCs向成脂、成骨和成软骨分化。软琼脂致瘤实验检测细胞致瘤性。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测hUC-MSCs在不同培养时期特定基因的甲基化状态。蛋白免疫印记(Western Blot)检测hUC-MSCs在不同培养时期MGMT基因的蛋白表达情况。实验结果显示,用手工机械+复合酶消化法分离hUC-MSCs,按整根脐带30cm计算,可收获3～6×106细胞。培养的hUC-MSCs均一稳定高表达CD29、CD73、CD105、CD90和CD44,低或不表达CD45、 CD34和HLA-DR。经分化培养基诱导可定向分化为成脂、成骨和成软骨细胞。软琼脂致瘤实验未见致瘤性。随着细胞的传代,衰老细胞占细胞总数的比例不断增加。MGMT基因在长期培养的hUC-MSCs出现甲基化,MGMT基因的转录和蛋白表达出现下降。研究结果表明本实验可较方便的从脐带中获得具有间充质干细胞特性的细胞。随着传代次数的增多,DNA修复基因MGMT出现甲基化,可能与hUC-MSCs衰老相关,需要进一步实验验证MGMT甲基化与衰老的相关性。