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溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种常见的慢性非特异性炎症性肠病,临床症状常为腹痛、腹泻、黏液脓血便等肠道症状,常伴有体重减轻、高热等全身症状。UC引起的肠道病变多位于结肠粘膜层及粘膜下层,在疾病活动期时肠道弥散性炎症可破坏肠壁原有黏液层,同时或继发性破坏肠粘膜屏障功能。肠粘膜屏障由上皮细胞(如大量杯状细胞)及细胞间连接(主要为紧密连接)组成。杯状细胞可分泌粘蛋白(Mucoproteins,MUC),是构成肠壁黏液层的主要物质之一;紧密连接包含多种紧密连接蛋白,如咬合蛋白(Occludin)、闭合蛋白(Claudin)、带状闭合蛋白(Zonula occludens,ZO)等,是构成肠粘膜机械屏障的蛋白框架。杯状细胞和(或)紧密连接蛋白被破坏会使肠粘膜自身保护作用减弱,当UC发生时,黏液层变薄或消失使病原微生物等有害物质直接接触肠粘膜诱发肠道炎症。Notch信号通路激活后可调节Th17/Treg细胞平衡向Th17细胞方向分化,使白介素家族-17(Interleukin-17,IL-17)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)等炎症因子分泌增多,加重粘膜炎症损伤;同时,过度活化的Notch信号介导肠上皮细胞由分泌细胞系(肠粘膜杯状细胞)向吸收细胞系(肠上皮柱状细胞)分化,使成熟态杯状细胞减少从而破坏肠壁黏液层的形成,加重肠粘膜屏障损伤。目的:探讨姜黄素(Curcumin,Cur)及双去甲氧基姜黄素(Bisdemethoxycurcumin,BDMC)对乙酸(Acetic Acid,AA)和葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的肠粘膜炎症反应、肠壁黏液层生成及肠粘膜屏障功能的影响及作用机制进行了初步研究。方法:1.探讨Cur及BDMC对乙酸诱导溃疡性结肠炎小鼠肠粘膜损伤的保护作用及相关作用机制取雌性BALB/c小鼠50只,随机分为正常对照组、5%AA模型对照组、Cur(200mg/kg)组、BDMC大剂量(200mg/kg)组、BDMC小剂量(100mg/kg)组。除正常对照组、5%AA模型对照组小鼠外,其余各给药组小鼠灌胃给予相应剂量受试药,1次/日,连续7日;正常对照组、5%AA模型对照组小鼠灌胃给予同等体积1%CMC-Na溶液。于末次给药24h后,除正常对照组外,其余各组小鼠采用乙酸灌肠法经肛门给予5%AA溶液100μl/只,正常对照组给予同等体积生理盐水。造模24h后,小鼠取血后,称量结肠重量及测量其长度同时计算肠重指数;观察结肠粘膜损伤大体情况,并进行结肠黏膜损伤指数(Colon mucosa damage index,CMDI)评分;取部分结肠固定于4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋切片,HE染色观察结肠粘膜病理变化,并进行结肠组织病理学评分(Histopathological score,HS);采用生化分析法检测结肠组织髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、前列腺素E-2(PGE-2)含量,同时测定血清中血小板凝集因子(PAF)、二胺氧化酶(DAO)含量;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测结肠组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)及IL-13含量;采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测结肠组织IL-17A、Notch信号通路受体1(Notch1)及Notch信号通路配体1(DLL1)表达量。2.探讨Cur及BDMC对葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎小鼠肠粘膜屏障的保护作用及相关作用机制取雌性BALB/c小鼠60只,随机分为正常对照组、3%DSS模型对照组、Cur大剂量(200mg/kg)组、Cur小剂量(100mg/kg)组、BDMC大剂量(200mg/kg)组、BDMC小剂量(100mg/kg)组。除正常对照组外,其余各组小鼠每日自由饮用3%DSS水溶液,连续饮用10天;正常对照组给予蒸馏水。造模同时除正常对照组、3%DSS模型对照组外,各给药组灌胃给予相应剂量受试药,每日1次,连续10日;正常对照组及3%DSS模型对照组灌胃给予相同体积1%CMC-Na溶液。在造模及给药期间小鼠每日称量体重,观察粪便性状,进行粪便潜血实验(Occult blood test,OBT),并计算疾病活动指数(Disease activity index,DAI)。末次给药24h后,各组小鼠取血后,称量结肠重量及测量其长度并计算肠重指数,脾脏称重并计算脾重指数;观察结肠粘膜损伤大体情况,并进行结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分;取部分结肠固定于4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋切片,HE染色观察结肠粘膜病理变化,并进行结肠组织病理学评分(HS),AB-PAS染色观察肠上皮细胞分化趋势,计算杯状细胞个数及测量黏液层厚度;采用生化分析法检测血清DAO、D-乳酸(D-La)含量;采用Western Blot法检测结肠组织紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-1、ZO-1)、Notch信号通路下游蛋白(Hes-1、Math-1)及粘蛋白(MUC2)的蛋白表达量。结果:1.Cur及BDMC对乙酸诱导的小鼠溃疡性结肠炎肠粘膜损伤的影响(1)小鼠结肠长度、重量及肠重指数结果与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠明显缩短、重量明显增加(P<0.01),肠重指数显著增加(P<0.001)。与模型组小鼠相比,Cur组、BDMC大剂量组小鼠明显抑制结肠缩短、减少结肠重量及降低肠重指数(P<0.01),BDMC小剂量组小鼠可抑制结肠缩短及降低肠重指数(P<0.05)。(2)小鼠结肠粘膜大体损伤情况及CMDI评分结果模型组小鼠结肠血肿明显,形成糜烂面和溃疡点,严重者出现大面积溃疡及炎性渗出,与正常组小鼠相比,模型组小鼠CMDI评分显著升高(P<0.001)。与模型组小鼠相比,给药组小鼠可不同程度缓解结肠血肿和溃疡,减少肠粘膜炎性渗出,降低CMDI评分:Cur组、BDMC大剂量组可明显降低小鼠CMDI评分(P<0.01),BDMC小剂量组可降低小鼠CMDI评分(P<0.05)。(3)小鼠肠粘膜组织病理学变化及结肠HS结果模型组小鼠结肠上皮及粘膜层结构不连续,粘膜层及粘膜下层有大量炎症细胞浸润,杯状细胞结构被破坏且数量明显减少,隐窝结构消失,与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠HS显著升高(P<0.001)。与模型组小鼠相比,给药组小鼠结肠上皮结构及肠粘膜损伤得到不同程度缓解,杯状细胞结构及排序较规律,隐窝结构修复,炎性细胞浸润现象减轻,BDMC大剂量组小鼠结肠HS显著降低(P<0.001),Cur组小鼠结肠HS明显降低(P<0.01),BDMC小剂量组可降低小鼠结肠HS(P<0.05)。(4)小鼠结肠组织MPO、SOD、MDA、NO、PGE-2及血清PAF、DAO含量结果与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠组织MPO、MDA、NO、PGE-2含量显著增加、SOD活力显著降低(P<0.001)。与模型组小鼠相比,BDMC大剂量组小鼠结肠MPO、MDA、NO、PGE-2含量显著降低、SOD活力显著增加(P<0.001);Cur组小鼠结肠MPO含量明显降低、SOD含量明显增加(P<0.01),MDA、NO、PGE-2含量显著降低(P<0.001);BDMC小剂量组小鼠结肠MPO、MDA、NO、PGE-2含量降低、SOD活力增加(P<0.05)。与正常组小鼠相比,模型组小鼠血清PAF、DAO含量显著增加(P<0.001)。与模型组小鼠相比,Cur组、BDMC大剂量组小鼠血清PAF、DAO含量显著降低(P<0.001),BDMC小剂量组小鼠血清PAF、DAO含量明显降低(P<0.01)。(5)ELISA法测定小鼠结肠组织TNF-α、IL-17、IL-13含量结果与正常组小鼠比较,模型组小鼠促炎因子TNF-α、IL-17含量显著增加(P<0.001),抗炎因子IL-13含量明显减少(P<0.01)。与模型组小鼠比较,Cur组、BDMC大剂量组小鼠TNF-α、IL-17含量显著减少(P<0.001),IL-13含量明显增加(P<0.01);BDMC小剂量组小鼠TNF-α、IL-17含量明显减少(P<0.01),IL-13含量增加(P<0.05)。(6)Western Blot法测定小鼠结肠组织IL-17A、Notch1、DLL1含量结果与正常组小鼠比较,模型组小鼠结肠组织IL-17A、Notch1蛋白表达量显著增加(P<0.001)、DLL1蛋白表达量明显增加(P<0.01)。与模型组小鼠相比,Cur组、BDMC大剂量组小鼠IL-17A、Notch1蛋白表达量显著降低(P<0.001)、DLL1蛋白表达量降低(P<0.05);BDMC小剂量组小鼠IL-17A、Notch1蛋白表达量降低(P<0.05)。2.Cur及BDMC对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎Notch信号通路及肠粘膜屏障的影响(1)小鼠DAI评价结果与正常组小鼠相比,模型组小鼠DAI从实验第5天起明显增加(P<0.01),第6天至实验结束显著增加(P<0.001)。与模型组小鼠相比,BDMC大剂量组可明显降低小鼠DAI(P<0.01),Cur大剂量组可降低小鼠DAI(P<0.05)。(2)小鼠结肠长度、重量、肠重指数及脾重、脾重指数结果与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠长度显著缩短,结肠重量显著增加(P<0.001)。与模型组小鼠相比,Cur大剂量组、BDMC大剂量组小鼠可明显抑制结肠长度缩短(P<0.01),显著抑制结肠重量增加(P<0.001);Cur小剂量组、BDMC小剂量组小鼠可抑制结肠长度缩短(P<0.05),抑制结肠重量增加(P<0.05)。与正常组小鼠相比,模型组小鼠肠重指数显著增加(P<0.001)。与模型组小鼠相比,Cur大剂量组、BDMC大剂量组小鼠可明显降低肠重指数(P<0.01),Cur小剂量组、BDMC小剂量组小鼠可降低肠重指数(P<0.05)。与正常组小鼠相比,模型组小鼠脾脏重量及脾重指数显著增加(P<0.001)。与模型组小鼠相比,BDMC大剂量组小鼠可显著降低脾脏重量及脾重指数(P<0.001),Cur大剂量组小鼠可降低脾脏重量及脾重指数(P<0.01)。(3)小鼠结肠粘膜大体损伤情况及CMDI评分结果与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠粘膜有明显血肿及渗出,大量糜烂和溃疡形成,肠壁较硬较厚,严重者溃疡较深并伴出血点,小鼠CMDI评分显著升高(P<0.001)。与模型组小鼠相比,给药组可不同程度缓解肠粘膜损伤,Cur大剂量组、BDMC大剂量组小鼠CMDI评分显著降低(P<0.001),BDMC小剂量组、Cur小剂量组小鼠CMDI评分具有明显统计学差异(P<0.01)。(4)小鼠肠粘膜组织病理学变化及结肠HS结果与正常组相比,模型组小鼠肠粘膜结构不连续,隐窝结构消失,杯状细胞解构及大量减少,粘膜下水肿,肠壁各层组织均有炎性细胞浸润,模型组小鼠结肠HS显著升高(P<0.001)。与模型组小鼠相比,给药组可减轻炎症浸润程度,恢复肠粘膜结构,Cur大剂量组、BDMC大剂量组小鼠结肠HS显著降低(P<0.001),BDMC小剂量组可明显降低小鼠结肠HS(P<0.01),Cur小剂量组可降低小鼠结肠HS(P<0.05)。(5)小鼠肠粘膜杯状细胞个数及黏液层厚度测量结果与正常组小鼠比较,模型组小鼠结肠粘膜被染色物质减少,杯状细胞个数显著减少(P<0.001)。与模型组小鼠相比,Cur大剂量组、BDMC大剂量组小鼠结肠粘膜被染色物质较多,杯状细胞个数显著增加(P<0.001);Cur小剂量组小鼠结肠粘膜被染色物质相对增多,杯状细胞明显增加(P<0.01);BDMC小剂量组小鼠结肠粘膜被染色物质增多,杯状细胞增加,具有统计学差异(P<0.05)。与正常组小鼠相比,模型组小鼠黏液层分布不连续,出现破损或消失,黏液层厚度明显变薄(P<0.01)。与模型组小鼠相比,Cur大剂量组、BDMC大剂量组可明显增加小鼠黏液层厚度(P<0.01);Cur小剂量组、BDMC小剂量组可增加小鼠黏液层厚度,具有统计学差异(P<0.05)。(6)小鼠血清DAO、D-La含量结果与正常组小鼠相比,模型组小鼠血清DAO、D-La含量显著升高(P<0.001)。与模型组小鼠相比,Cur大剂量组、BDMC大剂量组可明显降低小鼠血清DAO、D-La含量(P<0.01),Cur小剂量组、BDMC小剂量组可降低小鼠血清DAO、D-La含量(P<0.05)。(7)Western Blot法测定小鼠结肠组织Hes-1、Math-1、MUC2、Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达量结果结肠组织中Hes-1、Math-1、MUC2蛋白的Western Blot结果显示,与正常组小鼠比较,模型组小鼠结肠组织Hes-1蛋白表达显著增加,Math-1、MUC2蛋白表达显著降低(P<0.001)。与模型组小鼠相比,Cur大剂量组、BDMC大剂量组Hes-1蛋白表达明显降低(P<0.01),Math-1、MUC2蛋白表达明显增加(P<0.01);Cur小剂量组、BDMC小剂量组Hes-1蛋白表达降低(P<0.05),Math-1、MUC2蛋白表达增加(P<0.05)。结肠组织中Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白的Western Blot结果显示,与正常组小鼠比较,模型组小鼠结肠组织Occludin、Claudin-1蛋白表达显著减少(P<0.001),ZO-1蛋白表达明显减少(P<0.01)。与模型组小鼠相比,Cur大剂量组、BDMC大剂量组小鼠Occludin蛋白表达显著增加(P<0.001),Claudin-1、ZO-1蛋白表达明显增加(P<0.01)。Cur小剂量组和BDMC小剂量组小鼠Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达增加,具有统计学差异(P<0.05)。结论:1.姜黄素及双去甲氧基姜黄素均能够恢复溃疡性结肠炎导致的小鼠体重减轻、改善结肠症状及组织病理学损伤;2.姜黄素及双去甲氧基姜黄素均可通过抑制MPO、MDA、NO、PGE2、PAF含量,提高SOD活力,抑制结肠炎症及氧化应激反应;3.姜黄素及双去甲氧基姜黄素均可通过抑制Notch信号通路中Notch1及DLL1蛋白表达,进而抑制IL-17、TNF-α蛋白表达,减轻结肠粘膜炎症;4.姜黄素及双去甲氧基姜黄素也可调控Notch信号通路下游Hes-1、Math-1蛋白表达,进而促进MUC2蛋白表达,增加肠壁黏液层厚度;5.姜黄素及双去甲氧基姜黄素还可促进紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达,重构肠粘膜机械屏障。