MicroRNA-432影响成肌细胞增殖及期通过靶向MYOZ1基因影响肌纤维类型标记基因的表达

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MYOZ1基因在肌小节组装和不同类型肌纤维形成等过程中起到广泛的调控作用,MYOZ1的功能涉及骨骼肌快肌和慢肌的形成及比例。因其编码的蛋白在肌纤维Z线形成及快肌纤维相关生理过程中起关键作用而被广泛关注。该基因在骨骼肌生长发育、肌纤维类型调控以及动物的体型和肉质研究方面均具有重要研究价值,寻找影响MYOZ1基因表达的调控因子对改善家畜的肉质和体型方面有重要意义。本实验室利用芯片结果结合表达谱分析,初步确定miR-432和MYOZ1的靶向关系,通过研究靶向MYOZ1的miR-432及其在肌纤维类型变化中的调节作用,为探究miRNA调控骨骼肌生长发育及肌肉类型的分子机理奠定基础。取得的主要结果如下:   (1)运用定量Q-PCR进行MYOZ1基因的组织表达情况检测,在大白猪的心、肝、脾、肺、肾、小肠、骨骼肌和脂肪等组织中,该基因在骨骼肌中表达量最高而在其他组织中表达量较少。此外在猪胚胎期33天,65天和成年的骨骼肌中检测MYOZ1的表达量发现该基因的表达随着猪从胚胎期到成年呈上调表达。   (2)定量检测miR-432和MYOZ在C2C12细胞分化0天、1天、2天、4天和6天五个时期的表达量,发现miR-432随着细胞的分化呈显著的下调,而MYOZ1基因表达随着细胞的分化呈显著上调。   (3)通过细胞中检测双荧光素活性,初步证明miR-432和MYOZ1的靶向互做关系。通过Western Blot免疫印迹实验和免疫荧光实验检测MYOZ1蛋白表达水平可被miR-432下调,进一步说明MYOZ1是miR-432的靶基因。   (4)利用xCELLigence实时监测系统分析miR-432在C2C12细胞增殖中的作用时发现,讲内源表达的miR-432抑制后的C2C12细胞的增殖作用明显小于对照组细胞,说明抑制了miR-432后细胞的增殖速度下降,miR-432影响肌细胞增殖。   (5) C2C12细胞中过表达miR-432后分别分化培养1、3、5天,收集细胞总RNA通过Q-PCR技术检测快肌maker MYH4和慢肌maker MYH7的表达情况,结果表明过表达miR-432后慢肌maker表达量上升较快,说明miR-432可以促进慢肌的形成。通过在C2C12中过表达MYOZ1和抑制miR-432提高MYOZ1表达水平后再分别分化1、2、4天,检测快慢肌maker的表达情况,结果表明过表达MYOZ1和抑制细胞中本底的miR-432后,快肌makerMYH4的表达量上升较快,说明过量表达的MYOZ1和低量的miR-432导致快肌的生成量增多。
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