松花粉多糖酯化前后对小鼠结肠炎的作用及肠道菌群的研究

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松花粉的多糖和硫酸酯化多糖具有调节免疫功能的作用,能够刺激脾脏淋巴细胞分泌抗炎因子,通过荧光多糖示踪实验表明,松花粉多糖可以通过细胞表面受体Toll样受体4(TLR4)进入大鼠小肠隐窝上皮细胞。因此我们推测,松花粉可能会影响肠道免疫,改善肠道方面相关疾病。本实验以DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎为模型,通过肠道免疫水平、血清代谢组学和粪便宏基因组学三个层面探究松花粉的多糖和硫酸酯化多糖对小鼠体内炎症的作用。本实验主要包括以下几个部分:一、对云南松花粉多糖进行单糖组成分析以及硫酸化修饰。采用水煮醇沉法提取松花粉多糖,将60%乙醇沉淀的粗多糖命名为PPM60,主要由半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、鼠李糖和一种未知单糖组成。采用氯磺酸-吡啶法酯化松花粉多糖,并用BaSO4比浊法测得取代度为1.45,傅里叶红外光谱结果也说明多糖被成功酯化。二、以DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎为模型,研究松花粉的多糖和酯化多糖对结肠炎小鼠的作用。用C57BL/6小鼠饮用3%DSS水溶液5 d建立模型,实验分为四组:健康对照组(HC)、模型组(DSS)、多糖组(PM)和酯化多糖组(SPM)。结果发现,与HC组相比,DSS组小鼠体重减轻,DAI指数升高,结肠长度明显缩短,粘膜组织损伤严重,并且有大量的炎性细胞浸润,这说明小鼠结肠病变,造模成功。PM组和SPM组小鼠体重下降程度缓解,DAI评分低于DSS组,结肠长度缩短现象得到恢复,粘膜损伤程度轻于DSS组,说明PPM60和SPPM60对DSS诱导的结肠损伤有一定的修复作用,对结肠炎的发展和病变有改善作用。三、检测小鼠血清C反应蛋白(CRP)以及结肠组织中细胞因子的变化,研究多糖和酯化多糖对结肠炎小鼠肠道免疫的影响。结果发现,在DSS组中,血清CRP水平显著升高,抗炎细胞因子IL-2、IL-10和IL-13的水平降低,促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平升高。而在PM组和SPM组中这种现象得到改善,并且,PPM60在抑制促炎细胞因子水平上效果较好,SPPM60对抗炎细胞因子的作用效果更好。四、利用1H-NMR技术分析小鼠血清代谢组的变化。多元统计分析结果显示,四组小鼠具有分离趋势,并且当小鼠两两分组比较时都能得到良好的区分。对VIP值≥2的化学位移进行代谢物的定性,HC组和DSS组定性出N-乙酰-L-丙氨酸,乙酸,L-岩藻糖,乳酸,牛磺酸,甜菜碱,乙酰胆碱和阿洛糖等8种可能的差异性代谢物,DSS组和PM组定性出N-乙酰-L-丙氨酸,乙酸,乳酸,果糖-6-磷酸,阿洛糖,D-木糖和L-左旋肉碱等7种可能的差异性代谢物,DSS组和SPM组也定性出甜菜碱,甘油磷酸,L-丝氨酸,D-木糖,乙酰胆碱,乳酸和阿洛糖等7种可能的差异性代谢物。五、利用16S rDNA扩增子测序技术分析小鼠粪便和肠道内容物菌群,研究其物种多样性的变化以及PPM60和SPPM60对肠道菌群变化的作用。结果发现在DSS组小鼠肠道菌群中,物种多样性降低,有害菌丰度增加,有益菌丰度降低,菌群失衡。PPM60和SPPM60可以恢复物种多样性,并且对气球菌属和阿克曼菌属有下调作用,对乳杆菌属和副萨特氏菌属等菌属都具有上调作用。本实验结果表明,多糖和酯化多糖对DSS诱导的溃疡性结肠炎有改善作用,具体表现在改善结肠缩短,修复肠道损伤,减轻肠道炎症,调节血清代谢组以及调节肠道菌群的平衡等方面都起到积极作用。
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