研究背景蛋白质组学技术的飞速发展为检测蛋白质翻译后修饰提供了越来越强有力的工具。我们利用最新的质谱技术，建立了临床及实验标本的表观蛋白质组学分析平台，即通过高通量，高灵敏度的质谱检测，发现未知的蛋白质翻译后修饰，对疾病的发生机理做更深入的研究。肝癌标志物HAAH特异性地高表达于多种人类肿瘤组织，然而其与肿瘤发生相关的机理尚不清楚；肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）是一种涉及肝脏病理改变的全身性神经退行性疾病，其病理特征是蛋白聚集体的形成，具体机理仍未阐明。研究方法利用高效液相色谱（HPLC）通过延长的C18柱分离组织及细胞蛋白，随后在LTQ Velos Pro及Q-STAR Elite质谱仪上进行MS/MS分析，进行特定修饰的检索获得蛋白修饰数据，在此基础上分别建立了单个蛋白、蛋白复合体及全细胞组织活检样品的表观蛋白质组学研究平台：平台(I)为单个蛋白的表观蛋白质组学。蛋白样品包括：1）1D/2D SDS-PAGE胶上切下的条带或点（含有目标蛋白）；2）其他不同来源的单个蛋白样品。平台(II)为蛋白复合体的表观蛋白质组学。蛋白样品包括：1)免疫沉淀的蛋白产物；2)与其他蛋白免疫共沉淀的蛋白复合体；3)非变性蛋白胶中的蛋白复合体；4)其他方法分离的粗提蛋白；平台(III)为全细胞/组织/活检样品的表观蛋白质组学。蛋白样品包括：1)培养细胞的全细胞裂解液；2)来自动物及人类组织的全组织裂解液。具体研究方法包括：1）胶内酶解；2）溶液内酶解；3）LTQ Velos Pro及Q-STAR Elite质谱仪上不同时长的LC-MS/MS分析；4）使用SEQUEST检索感兴趣的目标蛋白；5）使用MASCOT/SEQUEST对目标蛋白的已知修饰进行检索；6）使用开放修饰检索（OPEN MODIFICATION）检索该蛋白的任何修饰（已知或未知的）。结果在表观蛋白质组学平台的基础上，结合生物化学、分子生物学、生物信息学等技术进行了如下三个部分的研究：1）肝癌标志物HAAH及Humbug的下游修饰检测（培养细胞样品）：成功克隆了HAAH及其截短体Humbug的基因，并在真核细胞HEK293中表达蛋白，结果发现HAAH及其截短体Humbug的过表达分别可引起HEK293细胞内不同蛋白的天冬酰胺及天冬氨酸残基发生β羟化反应。其中Heterogeneousnuclear ribonucleoprotein及HSP70家族的Heat shock cognate71kDa protein及Heatshock70kDa protein1A/1B均与肿瘤发生密切相关。2）ALS患者脊髓蛋白质修饰的检测（人类组织样品）：二维电泳及质谱分析发现ALS患者脊髓中存在大量不同修饰的蛋白，进一步分析发现ALS患者脊髓中GFAP（胶质纤维酸性蛋白）存在大量乙酰化修饰，且其不可溶聚集体中大片段的GFAP增多；Western blot，免疫沉淀及质谱分析发现ALS与非ALS脊髓中组蛋白等其他蛋白的乙酰化修饰也存在差异。3）SOD1G93A/+小鼠蛋白修饰的检测（模型动物样品）：与人类ALS脊髓蛋白相比，SOD1G93A/+小鼠脊髓GFAP蛋白存在大量保守的乙酰化修饰；ALS小鼠与非ALS小鼠脊髓的其他乙酰化蛋白存在巨大差异；ALS小鼠及非ALS小鼠脊髓中乙酰化的组蛋白不同。结论①肝癌标志物HAAH及Humbug在肿瘤组织中的过表达引起细胞恶性分化的机理可能与其对Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，Heat shock cognate71kDa protein及Heat shock70kDa protein1A/1B等蛋白的羟化修饰相关；②ALS患者脊髓中GFAP、组蛋白等蛋白质的乙酰化状态发生改变；③且这些改变在小鼠ALS模型SOD1G93A/+小鼠中高度保守，这为揭示ALS的发病机制提供了重要线索。本论文建立了单个蛋白、蛋白复合体及全蛋白的表观蛋白质组学检测平台，并在此基础上进行了细胞、人体标本、模型动物组织等三种不同来源蛋白的翻译后修饰研究。实践证明，该平台能够通过对多种来源样品的分析在短时间内获得大量蛋白质翻译后修饰等信息，在此基础上结合生物化学、分子生物学、生物信息学等技术，能够迅速发现大量有价值的表观蛋白质组学信息，对临床与基础医学研究均具有重要的指导意义。