【摘 要】
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黄病毒科黄病毒属的病毒是一类有囊膜的正链RNA病毒,主要通过蚊虫或蜱虫叮咬传播给人类。黄病毒包括寨卡病毒（ZIKV）、登革病毒（DENV）、西尼罗河病毒（WNV）、日本脑炎病毒（JEV）等等,对人类的生命健康一直是严重的威胁。比如2015年在美洲地区大规模爆发的寨卡病毒,病毒感染可能会导致格林巴氏综合征等严重的神经系统疾病,并且临床发现病毒感染孕妇之后会增加新生儿小头畸形的风险。另一种黄病毒登革病
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黄病毒科黄病毒属的病毒是一类有囊膜的正链RNA病毒,主要通过蚊虫或蜱虫叮咬传播给人类。黄病毒包括寨卡病毒（ZIKV）、登革病毒（DENV）、西尼罗河病毒（WNV）、日本脑炎病毒（JEV）等等,对人类的生命健康一直是严重的威胁。比如2015年在美洲地区大规模爆发的寨卡病毒,病毒感染可能会导致格林巴氏综合征等严重的神经系统疾病,并且临床发现病毒感染孕妇之后会增加新生儿小头畸形的风险。另一种黄病毒登革病毒,全球每年有1亿以上的人口感染,严重者会出现登革出血热等疾病,每年造成数以万计的人口死亡。目前,对于寨卡病毒、西尼罗河病毒等仍然没有可用的疫苗以及有效的防治手段。登革病毒虽然有一种疫苗被批准,但其接种范围也有限。因此筛选新的黄病毒的疫苗和治疗的药物非常重要。黄病毒基因组是一条长约11 kb的单股正链RNA,编码了 3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中,病毒的非结构蛋白NS3蛋白是一种多功能的蛋白,具有蛋白酶活性和解旋酶活性。NS3的蛋白酶活性需要NS2B的一段氨基酸序列作为辅因子才能正常发挥,也称为NS2B3蛋白酶。NS2B3蛋白酶是一个非常重要的抗病毒靶点,基于NS2B3的抗病毒筛选已有较多的研究,但是目前仍然没有一个可用于临床的药物。在本研究中,我们设计了一个新的筛选NS2B3蛋白酶抑制剂的体系。该体系是基于细胞中NS2AB3蛋白的自我切割,来进行小分子抑制剂的筛选。通过这一筛选系统,我们从78种小分子中筛选得到了 5个抑制蛋白酶体的抑制剂,可以在纳摩尔浓度下有效抑制ZIKV/DENVNS2AB3的自我切割。随后抑制寨卡和登革病毒复制的实验证明,这5个小分子可以有效抑制ZIKV/DENV病毒的复制。其中Bortezomib的效果最好,抑制ZIKV/DENV病毒复制的EC50在8nM左右。我们也利用复制子和免疫荧光等实验,证明了小分子抑制剂加入后,直接抑制了 ZIKV/DENV病毒复制。我们通过一系列实验对药物的作用机制进行了探究。首先通过体外的蛋白酶活性检测系统检测了 5种小分子抑制NS2B3蛋白酶的IC50,结果发现IC50在毫摩尔水平,与细胞中抑制病毒复制的EC50浓度相差很大,有些相差近千倍。通过检测小分子与NS2B3蛋白酶的亲和力,发现这5个抑制剂与NS2B3蛋白酶的亲和力很低。这提示了小分子可能通过宿主因子或细胞通路来抑制寨卡病毒的复制。我们接下来对Bortezomib做了主要探究。利用免疫荧光、蔗糖密度梯度离心、蛋白酶活检测以及免疫沉淀等实验,我们证明了加药处理会导致NS2B3的泛素化大量积累,形成聚集小体,从而丧失了蛋白酶活性,说明药物是通过抑制泛素-蛋白酶体降解通路,抑制了 NS2B3的蛋白酶活。病毒蛋白的泛素化是由E3泛素连接酶介导的,而目前还没有找到寨卡病毒NS2B3的E3泛素连接酶。我们通过质谱筛选并鉴定了 2个新的E3泛素连接酶HRD1和RNF126,它们都属于内质网相关降解通路（ERAD）上的E3泛素连接酶。通过免疫共沉淀以及免疫荧光等实验,验证了 HRD1与RNF126可以通过与寨卡或登革病毒的NS2B3相互作用,对其进行K48多聚泛素化修饰。HRD1与RNF126的过表达会造成NS2AB3的过度泛素化并造成其自我切割的抑制,我们通过进一步的病毒实验证明了,2个E3泛素连接酶在病毒复制过程中可以定位在病毒的复制位点,过表达HRD1和RNF126均可以显著抑制寨卡和登革病毒的复制。说明HRD1、RNF126以及其所在的ERAD通路在Bortezomib抑制病毒复制的重要作用。综上,本课题对黄病毒抑制剂以及药物的筛选提供了一种新的方向,并揭示了 Bortezomib抑制NS2B3蛋白酶的新的分子机制,为进一步研究黄病毒感染的分子机制以及药物筛选提供了新的思路。
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