1，3-丙二醇是一种重要的化工原料。生物法发酵生产1，3-丙二醇已经成为目前诸多科学家研究的热点。提高对高浓度1，3-丙二醇的耐受性是提高1，3-丙二醇产率的重要手段。 本文完成了来源于肺炎克氏杆菌编码1，3-丙二醇氧化还原酶的dhaT基因的克隆。首先利用Primer软件设计引物，其中上游引物P1为：5’-GGCCCATATGAGCTATCGTATGTTTGATTATC-3’，下游引物P2为：5’-ACTTGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3’，然后我们结合单因素法和均匀设计分别对多个影响因素进行考察，确定了从K.pneumoniae中利用PCR扩增获得目的基因的最优反应体系(20μL体系中包括50ng DNA模板，160μmol·L^-1each dNTP,1.1μmol·L^-1引物P1+P2，2μmol·L^-1 MgCl₂，2μL10×缓．冲液和1 U Taq DNA聚合酶，进行95℃300s→95℃ 60s，64℃ 70s，72℃ 120s，进行30个循环→72℃ 300s)，并运用生物信息学对dhaT基因及其编码蛋白进行分析、预测。发现该酶的pI值是5.94，分子量为41.5 kD，另外PDOR在核苷酸和氨基酸水平上保守性均较好，具有6个连续的β-折叠，在其氨基酸序列上发现Fe-NAD的结合位点，于是推测PDOR属于NAD辅酶依赖性甘油脱氢酶家族Ⅲ离子激活型脱氢酶。 本文针对构建突变文库的方法——易错PCR和DNA重排的反应体系进行了考察，运用均匀设计确定适合目的基因最优反应体系(20μL中加入7mmol·L^-1MgCl₂,0.5 mmol·L^-1 MnCl₂,dATP:dGTP:dTTP:dCTP=0.2 mmol·L^-1:0.2 mmol·L^-1:1 mmol·L^-1:1 mmol·L^-1,37.5pmol·L^-1引物，2μL 10×缓冲液和1 U Taq DNA聚合酶进行30个循环94℃ 30s，55℃ 30s，72^C 20min→72℃ 10 min反应)，同时确定了DNA重排中关键的第一步DNaseⅠ酶切反应的最佳体系(20 μL体系中消化约200ng的DNA样品，需0.25mmol·L^-1MgCl₂，50mmol·L^-1Tris-HCl（pH7.4）,0.75mmol·L^-1MnCl₂,0.0007 U DNase I，15℃下反应14min，然后80℃ 10min)。利用PDOR的脱氢酶特性，构建NAD⁺／NADH+H⁺辅酶再生和显色反应偶联体系作为筛选手段，并且20g·L^-11，3-丙二醇作为筛选的压力起点。