烯醇还原酶(enoate reductase.EC1.3.1.31)能够催化带有强吸电子基团的烯烃化合物碳碳双键的不对称还原，并获得相应的光学纯烷烃化合物。手性烷烃化合物是有机合成中的重要砌块，能够用来制备多种手性化合物和手性药物。经历了八十多年的密切研究，对烯醇还原酶的结构和功能积累了一定的认识，然而其酶源开发工作无法满足实际需求，迄今为止，经过功能识别的烯醇还原酶仅仅三十余种。因而发掘高催化活力、高稳定性以及高立体选择性的新型烯醇还原酶资源具有重要的研究意义与应用价值。　　本课题是首次从从金黄杆菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)中进行烯醇还原酶资源挖掘。通过基因组数据挖掘策略从其基因组挖掘到三个未表达的假定烯醇还原酶，分别命名为Chr-O YE1、Chr-OYE2与Chr-OYE3。Chr-OYE2属于拟噬热老黄酶亚家族，该亚家族成员明显少于典型老黄酶亚家族，本课题是对该亚家族的重要补充。本研究实现了以上三个假定烯醇还原酶的异源表达与分离纯化;并通过功能验证，证实以上三个假定烯醇还原酶具有不同程度的碳碳双键还原活力并对其分别进行了详细地特性表征。　　重组菌全细胞生物转化结果显示Chr-OYE1/3的碳碳双键还原活性明显优于Chr-OYE2，因而被作为后续酶学性能与酶蛋白稳定性研究工作的重点对象。纯化后的重组Chr-OYE1/3均具有典型的黄色蛋白特征吸收峰，并且非共价结合辅酶FMN。酶促反应动力学研究表明:Chr-OYE1/3能够利用NADH或NADPH作为还原力供体，但二者对NADPH的亲和力(Km)以及催化效率(kcat)均高于NADH。反应优化实验显示:Chr-OYE1的最适反应温度为40℃，最适反应pH为7.5; Chr-OYE3的最适反应温度为35℃，最适反应pH为6.5。　　Chr-OYE1对所用的16种底物均具有一定还原活力，对其中α，β-不饱和环状烯酮(1a、4a、6a)、α，β-不饱和酰亚胺(8a)、α，β-不饱和醛(9a、15a、16a)以及α,β-不饱和硝基化合物(10a、13a、14a)表现出相对较高的还原活力，并对底物8a、10a以及13a表现出较高的立体选择性。此外，Chr-OYE1对α，β-不饱和炔酮也表现出一定的还原活力，能够将底物4-苯基-3-丁炔-2-酮经4-苯基-3-丁烯-2-酮最终还原为4-苯基-2-丁酮，目前仅有4个家族成员能够催化这一反应。Chr-OYE1在其最适反应温度(40℃)下表现出较为优异的稳定性，热失活半衰期达到259 h。其最适有机助溶剂为异丙醇。　　Chr-OYE3对8种化合物表现出催化活力，对α，β-不饱和酰亚胺类化合物表现出相对较高的催化活力与立体选择性。稳定性研究结果显示:Chr-OYE3具有相对较为优异的温度与有机溶剂耐受性。在其最适反应温度(35℃)下的热失活半衰期达到233 h;在55℃下的热失活半衰期能够达到22 h。其半失活温度大约为70℃。Chr-OYE3能够耐受二甲基亚砜、乙二醇、甲醇、丙酮、异丙醇、甲基叔丁基醚、乙酸丁酯以及甲苯等8种不同极性的有机溶剂;当有机溶剂浓度到达30％时，其催化活力几乎未受影响;当有机溶剂浓度到达80％时，Chr-OYE3能够维持大于60％的催化活力。　　本课题填补了从金黄杆菌中挖掘烯醇还原酶资源的空缺，获得三个重组酶，并对其中的两个烯醇还原酶进行了详细的性能表征，为不对称还原工具箱的提供重要补充，同时体现了基因组数据挖掘策略作为新型的酶资源挖掘手段的高效性与可靠性。