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[背景]表皮葡萄球菌在手术缝合部位、引流口部位、中心静脉导管、心脏瓣膜置换术、植入假体等医源性感染灶中常有较高的检出率,是以生物材料为中心的感染(Biomateria] centered infections, BCI的主要致病菌之一。BCI的关键环节是细菌生物膜(Biofilm, BF)形成。低营养、高渗、酸碱度、低体温、胞外黏质物等环境因素的改变均影响葡萄球菌生物膜形成。在之前的研究我们发现在葡萄糖浓度11.1mmoL/L培养条件下,细菌有明显的生物膜形成。由于糖尿病体内免疫功能紊乱、氧化应激、动脉粥样硬化、血管舒缩功能障碍等因素,使糖尿病皮肤的屏障功能破坏。另外高血糖等代谢紊乱同时可使中性粒细胞的功能下降及表面的黏附因子增加,有助于微生物的聚集形成生物膜,从而使糖尿病易发生感染,并产生对抗生素的耐药,使糖尿病患者的生物材料感染表现为难治性。在采用皮下胰岛素输注管治疗的糖尿病患者中,皮下的输注管皮葡萄球菌的检出率高达21%。因此,研究高血糖状态下生物材料表皮葡萄球菌感染有重要意义。本研究的口的：通过体外实验,了解葡萄糖对表皮葡萄球菌在生物材料表面生物膜形成的影响,葡萄糖对ica、lux、hld基因表达的变化。通过检测葡萄糖对lux缺失菌株的ica、hld基因表达的变化的影响,进一步探讨luxS群体感应系统在葡萄糖诱导的生物膜形成与分离的具体机制。并采用高血糖生物材料感染动物模型,探讨1ux感应系统在高血糖状态的活体内生物材料细菌感染中的作用。第一部分：葡萄糖对表皮葡萄球菌在生物材料表面生物膜形成的影响[目的]观察不同浓度葡萄糖对表皮葡萄球菌在生物材料表面生物膜形成的影响。[方法]采用不同浓度葡萄糖培养表皮葡萄球菌生物材料感染模型。结晶紫染色法对生物膜进行半定量检测(0D490),绘制生长曲线。激光共聚焦显微镜观察不同葡萄糖浓度培养24h的生物膜的厚度,扫描电镜观察生物膜的超微结构。[结果]在不同葡萄糖浓度下,表皮葡萄球菌1457菌株在PVC表面的粘附的量随着培养时间逐渐上升。细菌在PVC表面的粘附量在12-24小时生成量最明显,均有生物膜的形成,其中24小时是高峰,24小时以后逐渐下降。葡萄糖浓度在11.1mmoL/L以上,细菌在PVC表面的粘附量生成量逐渐增加。培养24小时激光共聚焦显微镜观察Se1457生物膜形成：≥11.1mmoL/L葡萄糖各组与无葡萄糖组相比,其生物膜厚度明显增加(P<0.05),30-50mmoL/L生物膜形成能力最大,并趋于平稳,最高值在40mmoL/L组,当葡萄糖浓度≥60mmoL/L时,生物膜厚度反而下降,但仍然明显大于葡萄糖浓度≤20mmoL/L组。扫描电镜观察Se1457培养24小时在PVC表面均有明显的生物膜形成,生物膜厚度随着培养的葡萄糖浓度增加逐渐增厚,在葡萄糖浓度为40mmol/L水平时,PVC表面可见结构致密、高度组织化多细胞群体结构。生物膜形成阴性株(表皮葡萄球菌ATCC12228)中均无明显生物膜形成。[结论]在不同葡萄糖浓度下,表皮葡萄球菌生物膜形成阳性菌株在PVC表面粘附的细菌量随着培养时间的延长而上升；在一定时间内,细菌在PVC表面的生物膜厚度随着葡萄糖浓度的增加而逐渐增厚,当葡萄糖浓度达到一定水平后,生物膜厚度反而下降。在不同葡萄糖浓度下,生物膜形成阴性株中均无明显生物膜形成。第二部分：luxs系统在葡萄糖诱导生物材料表面生物膜形成与分离中的作用[目的]探讨葡萄糖诱导生物材料表面生物膜形成的分子机制。[方法]Real-time PCR法检测在葡萄糖浓度为40mmol/L培养24h表皮葡萄球菌ica、lux、hld基因mRNA表达的变化,了解葡萄糖诱导生物膜形成与分离的关键基因表达情况。检测表皮葡萄球菌Δlux突变株在葡萄糖浓度为40mmol/L培养24h后ica、hid基因mRNA表达的变化。[结果]葡萄糖诱导icaC基因mRNA表达,表达高峰在培养24小时；葡萄糖诱导hld基因mRNA表达,表达高峰后延；葡萄糖下调lux基因mRNA表达；葡萄糖诱导lux阴性突变株的ica基因表达明显增加：葡萄糖诱导lux阴性突变株的hid基因表达明显增加,高峰从30小时一直延续至72小时。[结论]葡萄糖通过诱导表皮葡萄球菌生物膜形成阳性菌株icaC基因mRNA的表达,促使细菌在生物材料表面生物膜的形成：在成熟的生物膜分离过程当中，葡萄糖通过诱导hld基因的表达,可能促使细菌生物膜的分离；lux基因对葡萄糖诱导的ica基因表达有负调节作用,对葡萄糖诱导的hid基因高表达有抑制作用。第三部分：高血糖树鼩对Δlux表皮葡萄球菌感染的黏附及清除能力的研究[目的]在高血糖的树鼩模型中,探讨高血糖对Alux表皮葡萄球菌在活体内植入性生物材料上细菌的生物膜形成和清除能力的影响。[方法]注射链脲佐菌素使树鼩血糖升高,采用表皮葡萄球菌Δlux、1457、ATCC12228感染不同血糖浓度的动物模型,并同时植入生物材料；感染7天后处死动物,检测动物重要脏器的感染率及细菌感染菌落计数；扫描电镜观察植入生物材料的生物膜形成情况；动物重要脏器的组织病理检查,显微镜下观察重要组织的炎症细胞浸润情况。[结果]感染生物膜形成阳性细菌且血糖≥11.1mmol／L组动物脏器感染率增高；感染Δlux菌株且血糖≥11.1mmol／L组中组织培养后菌落计数高于感染Se1457组；电镜下观察感染Δlux菌株且血糖≥11.1mmol／L组中的动物的体内静脉导管表面有明显的细菌生物膜形成；感染Δlux菌株且血糖≥11.1mmo1／L组中动物体内促炎因子明显增加,抗炎因子生成不足；感染生物膜形成阳性菌且血糖≥11.1mmol／L组动物脏器炎症细胞浸润明显,感染Δlux菌株且血糖≥11.1mmol／L组的动物脏器可见局部组织坏死。[结论]在动物实验中,高血糖状态明显诱导表皮葡萄球菌在生物材料上生物膜的形成；生物膜形成阳性细菌的lux基因突变株对高血糖状态动物的致病力、侵袭力增强。