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目的:分别构建人转录因子p53四价功能域/IgG3上游铰链区融合基因和抗前列腺癌/抗人CD3双特异性单链抗体,然后,将两段基因序列依次克隆入pUC18质粒中,构建可自动装配成四聚体的多价双特异性单链抗体,真核表达后经Ni2+-NTA superflow亲和柱纯化,获得具有生物学活性的多价抗体,为进一步的体内实验奠定了基础。 方法:利用递归聚合酶链式反应(recursive poiymerase chainreaction R-PCR),扩增人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因,将融合基因克隆入pUC18载体中,酶切鉴定及序列测定正确后,命名为Ip-pUC18。利用PCR方法分别扩增出编码抗前列腺癌单链抗体和抗人CD3单链抗体的基因序列,并在抗前列腺癌单链抗体基因序列3’端引入预先设计好的Linker序列,分别依次将两段基因序列克隆入pUC18及Ip-pUC18质粒中,得到双特异性单链抗体及多价抗体融合基因,分别命名为BsAb-pUC18及MAb-pUC18,测序正确后,利用EcoR和Hind Ⅲ酶切位点,将两段融合基因分别克隆入真核表达载体pSectag2-β中,得到 第四军医大学硕士学位论文 一 BsAb-psectagZ-B及 MAb-psectagZ-B,将上述质粒分别转染 Hela细胞, 进行表达,利用SDS-PAGE和Western印迹实验鉴定融合蛋白的表达,表 达产物经N广-wAsupo汁二。w亲和柱纯化后,利用流式细胞仪进行上述两 种抗体的活性测定。 结果:(1)递归 PCR扩增出约 160hP大小的片段,提取 IP-PUC18质粒 进行酶切鉴定,得到一段约160hP大小的片段,与PCR结果相符,测序结 果证实:序列与设计完全一致。(2)抗前列腺癌单链抗体和抗人CD3单链 抗体的PCR扩增产物大小均为750hP左右,将BSAb-PUCIS及eb-PUC18 质粒进行 EcoR与 Hnd Ill酶切后,分别得到大小为 1.skb及 l.7kb左右 的片段,测序结果证实:序列与设计完全一致。(3)将BsAb-psectagZ亿 及 MAb-pseCtagZ亿质粒进行EcOR与 Hnd Ill酶切后,分别得到大小为 1.skb及 1.7kb左右的片段,结果表明:抗前列腺癌/抗人CD3双特异性 单链抗体及多价抗体的表达载体构建成功。(4)SDS-PAGE和Western印迹 实验证明:BsAb-psectagZ士及hb-psectagZ仑质粒表达产物中分别含 有约6kD及盯M大小的特异蛋白条带;表达产物经N广-叮比u昨r门。w 亲和柱纯化后,经凝胶灰度扫描证实两种蛋白的纯度均可达到90%以上。 (5)流式细胞仪结果显示:多价抗体及双特异性抗体均可以特异性的结合 PBMC及PC-3细胞,具有较好的生物学活性,并且多价抗体与PBMC及PC-3 细胞的亲和力明显高于双特异性抗体。 结论:门)成功的构建了人IgG3上游铰涟区冲3四价功能域融合基 因,为进一步构建多价抗体奠定了实验基础,并为提高抗体亲和活性开辟 了新的思路;Q)用基因工程方法制备了具有生物学活性的抗前列腺癌/ 抗人CD3双特异性单链抗体及多价抗体,为进一步的体内实验奠定了基 础,同时,探索治疗前列腺癌的新方法。 .4- 第四军医大学硕士学位论文一