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目的：分别构建人转录因子p53四价功能域／IgG3上游铰链区融合基因和抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体，然后，将两段基因序列依次克隆入pUC18质粒中，构建可自动装配成四聚体的多价双特异性单链抗体，真核表达后经Ni2+-NTA superflow亲和柱纯化，获得具有生物学活性的多价抗体，为进一步的体内实验奠定了基础。 方法：利用递归聚合酶链式反应（recursive poiymerase chainreaction R-PCR），扩增人IgG3上游铰链区／p53四价功能域融合基因，将融合基因克隆入pUC18载体中，酶切鉴定及序列测定正确后，命名为Ip-pUC18。利用PCR方法分别扩增出编码抗前列腺癌单链抗体和抗人CD3单链抗体的基因序列，并在抗前列腺癌单链抗体基因序列3’端引入预先设计好的Linker序列，分别依次将两段基因序列克隆入pUC18及Ip-pUC18质粒中，得到双特异性单链抗体及多价抗体融合基因，分别命名为BsAb-pUC18及MAb-pUC18，测序正确后，利用EcoR和Hind Ⅲ酶切位点，将两段融合基因分别克隆入真核表达载体pSectag2-β中，得到 第四军医大学硕士学位论文 一 BsAb－psectagZ－B及 MAb－psectagZ－B，将上述质粒分别转染 Hela细胞， 进行表达，利用SDS－PAGE和Western印迹实验鉴定融合蛋白的表达，表 达产物经N广－wAsupo汁二。w亲和柱纯化后，利用流式细胞仪进行上述两 种抗体的活性测定。 结果：（1）递归 PCR扩增出约 160hP大小的片段，提取 IP－PUC18质粒 进行酶切鉴定，得到一段约160hP大小的片段，与PCR结果相符，测序结 果证实：序列与设计完全一致。（2）抗前列腺癌单链抗体和抗人CD3单链 抗体的PCR扩增产物大小均为750hP左右，将BSAb－PUCIS及eb－PUC18 质粒进行 EcoR与 Hnd Ill酶切后，分别得到大小为 1．skb及 l．7kb左右 的片段，测序结果证实：序列与设计完全一致。（3）将BsAb－psectagZ亿 及 MAb－pseCtagZ亿质粒进行EcOR与 Hnd Ill酶切后，分别得到大小为 1．skb及 1．7kb左右的片段，结果表明：抗前列腺癌／抗人CD3双特异性 单链抗体及多价抗体的表达载体构建成功。（4）SDS－PAGE和Western印迹 实验证明：BsAb－psectagZ士及hb－psectagZ仑质粒表达产物中分别含 有约6kD及盯M大小的特异蛋白条带；表达产物经N广－叮比u昨r门。w 亲和柱纯化后，经凝胶灰度扫描证实两种蛋白的纯度均可达到90％以上。 （5）流式细胞仪结果显示：多价抗体及双特异性抗体均可以特异性的结合 PBMC及PC－3细胞，具有较好的生物学活性，并且多价抗体与PBMC及PC－3 细胞的亲和力明显高于双特异性抗体。 结论：门)成功的构建了人IgG3上游铰涟区冲3四价功能域融合基 因，为进一步构建多价抗体奠定了实验基础，并为提高抗体亲和活性开辟 了新的思路；Q)用基因工程方法制备了具有生物学活性的抗前列腺癌／ 抗人CD3双特异性单链抗体及多价抗体，为进一步的体内实验奠定了基 础，同时，探索治疗前列腺癌的新方法。 ．4－ 第四军医大学硕士学位论文一