院外心脏骤停患者初始心肺复苏(Cardiopulmonary resuscitation，CPR)成功率约为40％，但大部分初始复苏成功的患者死于复苏后72小时内，心跳骤停患者心肺复苏后最终仅有约1.4％—5％能够生理功能相对正常存活。复苏后心功能不全是初期复苏成功后数小时、数天高致死率的重要原因。保护心跳骤停全心缺血再灌注损伤的心肌，救治复苏后心功能不全，最终改善心肺复苏预后是急诊医学研究的重要课题。多种疾病的发生发展都是致伤和抗损伤因素相互作用的过程，既往复苏后心功能不全的干预手段多侧重于减轻致损伤因素，而对于全身缺血再灌注损伤应激下的机体内源性保护机制较少涉及。 近些年来，在器官保护领域的研究中血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)备受关注。HO-1是血红素分解代谢的关键限速酶，产生三种重要产物胆红素、一氧化碳(CO)和Fe2+，具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡等多重保护效应。多种具有氧化应激性质的刺激可诱导其表达，HO-1拮抗细胞应激，维持机体稳态，是重要的内源性防御保护系统，已在器官移植等领域显示明确保护效应。复苏后心功能不全是独特的全身缺血再灌注背景下发生的心肌损伤，可否通过扶持HO-1内源性防御保护系统，增强机体的抗损伤、抗应激能力，从而保护复苏后心肌不得而知。本研究设想诱导HO-1过表达，探讨其对心肺复苏大鼠缺血再灌注损伤的心肌及体外培养心肌细胞缺氧再复氧损伤的保护作用，并初步阐述其发挥保护效应的机制。 第一部分血红素氧合酶-1对心肺复苏大鼠心肌缺血 再灌注损伤的保护作用研究 研究目的： 建立大鼠心跳骤停-心肺复苏动物模型，给予血红素氧合酶-1(HO-1)诱导剂血晶素(Hemin)和抑制剂锌原卟琳(ZnPP)，研究HO-1在心肺复苏大鼠心肌的表达对复苏中心肌缺血再灌注损伤的影响，并从炎症因子释放和氧化/抗氧化角度对HO-1在复苏后心肌损伤中的可能作用机制作一探讨。 材料和方法： 建立窒息法致大鼠心跳骤停-心肺复苏动物模型，应用HO-1诱导剂Hemin和抑制剂ZnPP预处理心肺复苏大鼠，设假手术组、CPR组、Hemin组和Hemin+ZnPP组四个实验组，每组分复苏后6h和24h两个亚组。采用蛋白免疫印迹和免疫组化方法检测大鼠心肌HO-1蛋白表达水平；监测大鼠复苏后4h内的血流动力学；观察大鼠复苏后心肌酶学指标及心肌超微结构变化。分别采用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化法测定复苏大鼠心肌组织匀浆丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，ELISA法检测大鼠复苏后血清肿瘤坏死因子—α(TNF-α)和白细胞介素—6(IL—6)水平。免疫组化方法检测大鼠复苏后心肌硝基硌氨酸蛋白表达。 结果： 1、大鼠复苏后心肌HO-1表达 较假手术组比较，CPR组HO-1蛋白表达明显升高，Hemin进一步诱导HO-1表达，ZnPP可抑制HO-1表达。 2、大鼠复苏后心功能比较 CPR组复苏后反映心室收缩功能和舒张功能的dP/dt40、—dP/dt均显著低于复苏前，Hemin组dP/dt40复苏后无显著性变化，—dP/dt复苏后短暂降低，2h后恢复至复苏前水平。Hemin组复苏后各时相dP/dt40、—dP/dt均高于CPR组和Hemin+ZnPP组。 3、大鼠复苏后心肌酶学变化 CPR组复苏后血清LDH、CPK—MB明显升高，复苏后6 h及24 h时相亚组，Hemin组CPK—MB、LDH值均低于CPR组及Hemin+ZnPP组。后两组之间，复苏后心肌酶水平无显著性差异。 4、各组复苏后6h心肌超微结构的变化 CPR组复苏后心肌线粒体肿胀、灶性空化，嵴模糊不清，肌节结构模糊。Hemin组仅少部分线粒体轻微水肿，嵴清晰，肌丝清晰，复苏后心肌超微结构完整性明显优于CPR组。ZnPP抑制HO-1表达后，心肌损伤加重。 5、大鼠复苏后血清炎症因子变化 与假手术组比较，CPR组大鼠复苏后血清TNF—α、IL—6均明显升高，Hemin诱导HO-1表达增高后，明显抑制炎症因子的释放。Hemin组复苏后24h TNF—α水平已接近假手术组，IL—6水平复苏后未见明显升高。ZnPP抑制HO-1表达后，Hemin+ZnPP组复苏后TNF—α、IL—6水平亦明显升高，与CPR组水平无显著性差异。 6、大鼠复苏后心肌氧化应激指标变化 与假手术组比较，CPR组复苏后6h、24h心肌组织匀浆MDA均升高，SOD降低，心肌组织硝基硌氨酸蛋白表达明显增多。Hemin组诱导HO-1表达后，心肌MDA降低，SOD升高，明显抑制心肌硝基硌氨酸蛋白表达。ZnPP抑制HO-1表达后，Hemin的保护作用消失。 结论： 1、心肺复苏中全心缺血再灌注损伤诱导心肌组织HO-1的表达上调。 2、Hemin诱导心肌HO-1过表达，可减轻心肌损伤，保存心肌超微结构完整，改善复苏后心功能。 3、HO-1过表达可抑制复苏后炎症因子的释放，改善心肌氧化应激状态，可能是HO-1对复苏后心肌损伤发挥保护作用的机制。 第二部分血红素氧合酶-1对缺氧再复氧损伤心肌细胞的保护作用研究 研究目的： 在体外原代培养乳鼠心肌细胞，建立心肌细胞缺氧再复氧损伤模型，在体外试验中模拟心肺复苏过程中的心肌缺血再灌注损伤过程。在细胞水平证实诱导HO-1过表达，对缺氧再复氧损伤心肌细胞是否有保护效应，并初步探讨其机制。 材料和方法： 酶消化法原代培养乳鼠心肌细胞，采用无糖、无血清、0.5％O2培养2h，恢复糖、血清及氧供应6h建立心肌细胞缺氧再复氧损伤模型。应用Hemin和ZnPP缺氧前24h预处理心肌细胞，设正常对照组(C组)、缺氧再复氧组(HR组)、Hemin组及Hemin+ZnPP组。采用采用蛋白免疫印迹和免疫组化方法检测心肌细胞HO-1蛋白表达；观察细胞再复氧后上清LDH水平，胎盘兰染色观察心肌细胞活力；观察心肌细胞形态及超微结构变化。测定细胞上清MDA和SOD水平，以及TNF—α、IL—6水平。免疫组化方法检测心肌细胞再复氧6h硝基硌氨酸蛋白表达。 结果： 1、心肌细胞原代培养 采用酶消化法原代培养乳鼠心肌细胞，经α—横纹肌肌动蛋白细胞免疫化学鉴定心肌细胞纯度为90.5±1.4％，培养至第4天心肌细胞搏动频率180次/min左右。 2、心肌细胞缺氧再复氧损伤模型建立 心肌细胞培养至第5天，0.5％O2、无糖、无血清培养2h，恢复糖、血清及氧供应正常培养6h，胎盘兰染色示心肌细胞活力降低，搏动减慢，细胞皱缩，颗粒增多，电镜下见线粒体肿胀，嵴断裂，肌丝模糊。缺氧再复氧处理导致心肌细胞功能、结构明显损伤。 3、心肌细胞缺氧复氧后HO-1表达 蛋白免疫印迹和免疫组化方法证实心肌细胞缺氧再复氧后HO-1表达增高，Hemin处理进一步升高HO-1表达，ZnPP抑制HO-1表达。 4、缺氧复氧后心肌细胞活力变化 HR组缺氧再复氧后LDH释放增多，胎盘兰染色细胞存活率明显下降，Hemin预处理诱导HO-1过表达，降低缺氧再复氧心肌细胞LDH释放，提高细胞存活率。ZnPP抑制HO-1表达，阻断Hemin的保护作用。 5、心肌细胞缺氧复氧后病理形态变化 HR组缺氧再复氧后，细胞损伤重，线粒体肿胀、空泡变性，嵴溶解消失，肌浆网扩张，心肌细胞肌丝排列紊乱。Hemin处理诱导HO-1过表达，明显保持心肌细胞缺氧再复氧后形态学和超微结构的完整性，ZnPP可阻断其保护效应。 6、心肌细胞缺氧复氧后炎症因子水平 HR组细胞缺氧复氧后细胞上清TNF—α、IL—6水平升高，Hemin处理诱导HO-1过表达降低细胞缺氧复氧后TNF—α、IL—6的释放。 7、心肌细胞缺氧复氧后氧化应激指标 HR组细胞缺氧复氧后细胞上清MDA水平增高，SOD降低，免疫细胞化学示硝基硌氨酸蛋白表达增高。Hemin诱导HO-1过表达可降低MDA，升高SOD，降低硝基硌氨酸蛋白表达。ZnPP抑制HO-1表达后，可阻断Hemin的保护作用。 结论： 1、成功建立较好模拟体内缺血再灌注损伤的体外心肌细胞缺氧再复氧损伤模型。 2、心肌细胞缺氧再复氧诱导HO-1表达，Hemin进一步提高HO-1表达，同时减轻心肌细胞损伤，提高细胞活力。 3、缺氧再复氧导致心肌细胞释放炎症因子，存在氧化应激损伤，HO-1表达增高减轻以上病理过程，可能是其保护缺氧再复氧损伤心肌细胞的机制。