三阴性乳腺癌（TNBC）是一种缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER-2）的乳腺癌,具有恶性程度高、易复发、易转移及预后差等特点,因此目前尚无针对TNBC的靶向治疗策略。研究表明,转移是造成三阴性乳腺癌患者死亡的主要因素,而转移作为一个复杂的病理过程,雌激素和血小板在此过程中起着重要的驱动作用。雌激素不仅能提高肿瘤细胞的增殖速率,还能增加肿瘤细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达,使细胞外基质降解,促进肿瘤细胞的转移;而肿瘤细胞外基质的降解可引发血小板瘤内浸润的增加,这使肿瘤细胞激活更多的血小板,活化的血小板通过分泌TGF-β,促进肿瘤细胞发生上皮间质转化（EMT）,使其更容易发生转移。此外,活化的血小板可与肿瘤细胞结合,帮助其在血液循环中实现免疫逃逸。因此,有效下调肿瘤组织雌激素水平,阻断血小板激活将是一种有前景的抗三阴性乳腺癌转移策略。基于此,本课题开发了一种铜基生物活性纳米囊泡（简称为CPAD）,它可以消耗雌激素,协同一氧化氮（NO）的产生阻断血小板激活,协同抑制TNBC的增殖和转移。CPAD的制备方法是将顺铂/精氨酸前药（Pt-Arg）载入铜基MOF（Cu-GA）中,并用亲水壳层（DSPE-PEG2000）修饰而成。设计的CPAD可在酸性条件下特异性释放铜离子和前药Pt-Arg,铜离子催化雌激素氧化,降低肿瘤原位雌激素水平,从而通过ERK/CANP/MMP-2途径抑制TNBC转移。同时,释放的Pt-Arg前药在肿瘤组织GSH的激活下产生游离的Pt和L-Arg,Pt在NOX酶作用下生成H2O2,进而氧化L-Arg产生NO来阻止活化血小板诱导的肿瘤EMT。因此,CPAD凭借局部雌激素调控和血小板活化阻断作用,使4T1乳腺癌模型中肺转移的抑制率高达88.4%。更重要的是,局部的雌激素下调、NO的产生和Pt介导的化疗共同提高了原发肿瘤的治疗效果,且该纳米系统对机体无显著的毒性。因此,本研究提出了一种协同雌激素调节和血小板激活阻断的治疗策略抑制TNBC的增殖和转移,具体研究内容如下:1、CPAD纳米系统的制备与表征。首先制备前药Pt-Arg（PA）,1H NMR和HPLC的数据证实PA的成功合成及具备GSH响应性。合成铜基MOF（Cu-GA）纳米粒后,通过物理搅拌将Pt-Arg载入Cu-GA中,然后修饰DSPE-PEG2000,得到CPAD纳米粒,DLS及TEM等结果显示CPAD水合粒径为200±10 nm,电位为-33.1 m V。在p H 7.4条件下,CPAD纳米粒稳定性良好,而在p H 4.5条件下Cu2+的释放率达89.14%,Pt-Arg的释放率高达95.43%,表明其在肿瘤酸性溶酶体条件下,具有释放药物的能力。其次,通过检测H2O2的产生,验证铜离子的雌激素消耗能力;使用NO检测试剂盒,验证前药Pt-Arg产生NO的能力,其中10 m M Pt-Arg与10 m M H2O2反应后NO的产量约为185±10μM。DLS实验结果显示CPAD纳米粒具有良好的稳定性和分散性。2、CPAD纳米系统调控雌激素和阻断血小板活化的体外特性考察。本研究以三阴性乳腺癌细胞4T1为模型。首先,细胞摄取实验证明4T1细胞对CPAD纳米粒的摄取具有时间依赖性,且该制剂能成功实现溶酶体逃逸。其次,本研究发现E2通过ERK/CANP信号通路使MMP-2的表达水平上调,而CPAD可使细胞内Cu2+含量显著增加,成功下降胞内雌激素含量,进而下调MMP-2水平。此外,CPAD作用后细胞内生成大量H2O2和NO。血小板聚集实验、细胞免疫荧光实验及Western Blot实验结果表明NO能显著抑制血小板的激活和聚集,从而阻断肿瘤细胞的形变和EMT转化。这些实验结果证实CPAD纳米粒在体外能通过产生铜离子和NO,有效调节雌激素和阻断血小板激活,从而抑制肿瘤细胞MMP-2的表达和EMT的转化。3、CPAD纳米系统的体外抗肿瘤和抗转移活性研究。首先,由细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验结果可知,血小板作用后4T1细胞的迁移和侵袭能力增加,且加入E2后其迁移和侵袭能力进一步增强,这与血小板的促EMT作用和E2诱导的MMP-2表达有关,而制剂CPAD能通过雌激素调控和血小板阻断显著抑制4T1细胞的迁移和侵袭。此外,细胞毒性实验、Calcein-AM/PI染色实验及细胞凋亡实验的结果表明,空白载体CD对细胞具有部分的抑制能力,但协同前药后,CPAD纳米粒的抗肿瘤效果最显著,50μg/m L的CPAD处理细胞后活力为27.1%、细胞凋亡率为53.7%。这些结果表明,CPAD在体外不仅能有效抑制三阴性乳腺癌的侵袭和转移,还能高效发挥抗肿瘤作用。4、CPAD纳米系统的体内抗肿瘤和抗转移活性研究。本研究建立4T1乳腺癌原位肿瘤动物模型,首先通过负载近红外荧光染料IR783表征制剂在小鼠肿瘤部位的聚集和主要器官的分布。其次,通过肿瘤体积、肿瘤组织质量、H&E切片染色及TUNEL荧光染色评价CPAD的抗肿瘤特性,结果表明CPAD纳米粒具有显著的抗原发肿瘤效果,其治疗后瘤体积增长缓慢,肿瘤质量明显下降,细胞核大量皱缩且完整性较差,抑瘤率高达80.9%。然后,小鼠肺组织称重、肺部转移灶计数、Bouin’s和H&E染色结果表明,CPAD治疗后其肺组织重量与正常小鼠无异,且几乎未见肺转移结节,转移抑制率高达88.4%。接下来,通过ICP-MS、Western Blot、免疫组化和免疫荧光实验探讨CPAD的体内抗转移机制,发现给药后肿瘤组织Cu2+、ROS、NO和E-cadherin含量显著增加,而E2、Capn4、MMP-2、P-选择素、TGF-β和N-cadherin指标明显下降,这证实CPAD通过触发雌激素下调协同血小板阻断的抗转移机制。最后,我们对制剂的生物安全性进行了初步评价,结果表明CPAD具备良好的生物安全性。总之,本课题合成了负载顺铂前药的铜基纳米活性系统,通过化疗、雌激素调控和血小板活化阻断等作用,实现高效的抗肿瘤和抗转移治疗,较好的生物安全性表明其具备一定的临床潜力,这为治疗三阴性乳腺癌的转移提供了新思路。