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WRKY基因家族是高等植物中的一类转录调控因子,在植物抗逆反应过程中扮演了重要角色,其表达受上游启动子中顺式作用元件和反式作用因子的相互协调调控。因此,剖析WRKY应答逆境的顺式作用元件并鉴定与其互作的转录因子,有利于阐明WRKY所介导的植物应答逆境胁迫的分子机制。前期本实验室从辣椒cDNA文库中分离获得了 CaWRKY27,发现该基因在辣椒防御应答高温、高盐及青枯病原菌等胁迫中具有重要作用。为了进一步阐明其表达调控机制,本研究获得了 Ca WRKY27上游启动子,并构建该启动子的系列含有GUS报告基因的5’-端缺失融合体。采用烟草遗传转化法获得相应的转基因植株,对T1代转基因烟草苗结合辣椒叶片瞬间表达系统中进行一系列逆境处理后,检测相应的GUS酶活性,对CaWRKY27启动子的功能进行了初步分析,并鉴定出几个可能与CaWRKY27启动子结合的WRKY蛋白,主要研究结果如下:利用Gateway技术构建了CaWRKY27启动子的GUS报告基因融合表达载体及其6个5’-端缺失体,分别命名为:p1608、p1281、p1066、p888、p636、p528、p369;并采用农杆菌介导的叶盘法进行烟草遗传转化获得了相应的转基因植株及其T1代株系。2、利用高温、高盐等逆境及SA、JA、ET、ABA等外源激素处理T!代转基因株系的幼苗,结合相应的GUS酶活性检测。发现CaWRKY27启动子在SA、青枯病原菌接种、高盐的条件下,-528～-369 bp间均能使其GUS酶活性表达增强。在JA的作用下,-888～-636 bp区域内能使其GUS酶活性表达增强。在ET的作用下,在-1066～-888 bp区域内能使其GUS酶活性表达增强,但在高温的作用下,在该区域内却使该启动子的GUS酶活性表达下调。在ABA的作用下,在-369～-1 bp区域能使其GUS酶活性表达增强。3、通过瞬间表达分析,发现Ca WRKY27启动子的-369～-1bp、-528～-369bp、-888～-636bp 区域分别与 CaWRKY1/58、CaWRKY40、CaWRKY27/6 结合,激活下游GUS报告基因表达。4、进一步通过定点突变分析,发现Ca WRKY27启动子应答SA的元件是位于-415～-406 bp 的 TCA-element;应答 JA 的元件是位于-748～-742 bp 的 W-box;应答ET的元件可能是位于-1051～1044 bp的ERE元件及-923～-918 bp的W-box;应答ABA的元件可能是位于-222～-218 bp的ABRE元件;应答高盐的元件是位于-686～-681 bp的GT-1元件和-438～-433 bp的GT-1元件;应答青枯病原菌侵染的可能是位于-455～-450 bp的W盒,但在-1066～-888 bp区域未找到应答高温的相关元件。5、为了确定WRKY蛋白特异结合CaWRKY27启动子中W-box的具体位点,本研究通过定点突变及辣椒叶片瞬间表达分析,结果表明:CaWRKY1与CaWRKY27 启动子上的 1W-box/2W-box/4W-box 结合、CaWRKY40 与 2W-box结合、CaWRKY58 能与 1W-box/4W-box 结合、CaWRKY27 及 CaWRKY6 与1 W-box结合时均能启动下游GUS报告基因的增强表达,而相应的W-box突变后则表达减弱。6、通过染色质免疫共沉淀试验,可以看出CaWRKY27启动子上的W-box不仅能与自身的CaWRKY27蛋白结合,还能与其他蛋白特异结合,但是一旦W-box的特异序列上的碱基突变掉,与之结合能力也随之减弱甚至消失。综上所述,CaWRKY27通过其启动子上的不同元件与包括自身在内的各种WRKY蛋白的转录因子结合,应答病原菌、盐胁迫等生物及非生物逆境胁迫,在植物应答这些逆境胁迫的防御反应中起重要调节作用。