【摘 要】
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基因治疗作为一种新兴的治疗策略,因其对基因相关疾病具有显著治疗效果而被广泛研究和关注。但缺少安全、高效的基因载体一直以来都是限制基因治疗发展的主要瓶颈之一。病毒型载体具有装载容量大和基因转染效率高等优势,但严重的免疫原性、致瘤性等缺陷导致其在临床应用中受到限制。非病毒型载体因具有低毒性和低免疫原性等优势而更具潜力。聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）是非病毒基因载体的杰出代表。
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基因治疗作为一种新兴的治疗策略,因其对基因相关疾病具有显著治疗效果而被广泛研究和关注。但缺少安全、高效的基因载体一直以来都是限制基因治疗发展的主要瓶颈之一。病毒型载体具有装载容量大和基因转染效率高等优势,但严重的免疫原性、致瘤性等缺陷导致其在临床应用中受到限制。非病毒型载体因具有低毒性和低免疫原性等优势而更具潜力。聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）是非病毒基因载体的杰出代表。得益于丰富的氨基含量,PEI显示出优异的DNA凝聚能力和显著的“质子海绵”效应。然而,PEI表面过量的正电荷使得PEI/DNA复合物易与体内负电性的生物分子发生静电相互作用,导致复合物的体内稳定性较差,基因递送效率低下,并产生阳离子细胞毒性。针对这一问题,现有方法主要以接枝策略为主。即通过中性分子接枝PEI降低其毒性,但在此过程中会消耗PEI的部分氨基,使其与DNA的静电结合能力下降,基因递送效率降低。因此,我们基于仿生原理,提出了源于“向自然学习”理念的细胞膜“包衣”策略。针对PEI作为基因载体表现出的高毒性和无靶向性等问题,通过利用细胞膜对PEI/DNA复合物表面进行“包衣”,以制备CM/PEI/DNA capsule（简称CPDc）仿生基因递送体系,实现安全的基因递送;同时,利用与靶细胞同源的细胞膜对载体进行“包衣”,以实现基因的靶向递送。根据以上思路,本课题尝试构建并评价了基于细胞膜“包衣”的基因递送系统,具体内容如下:1.通过细胞膜“包衣”策略降低PEI/DNA复合物的细胞毒性,并提高其基因递送效率。以不同质量的293T细胞膜,通过挤压法对已确定质量比的PEI30k/DNA和PEI70k/DNA复合物进行“包衣”,合成一系列质量比梯度的293T-CM/PEI30k/DNA capsule（简称293T-CP30Dc）和293T-CM/PEI70k/DNA capsule（简称293T-CP70Dc）复合物。表征结果显示,复合物表现为200 nm左右的“核-壳”结构,证明其成功合成。细胞膜对PEI/DNA复合物有较高的包封率,且可保护DNA不被核酸酶水解。安全性结果显示,相较于PEI/DNA复合物,293T-CP30Dc和293T-CP70Dc复合物的安全性均有显著提高。细胞膜“包衣”可有效提高体外细胞摄入效率,在质量比为2/0.75/1时,293T-CP70Dc复合物摄入效率最高,为92.4%,远高于PEI70k/DNA复合物;在此质量比下,293T-CP70Dc复合物表现出最高的转染效率,为76.2%,比PEI70k/DNA复合物高约10%。以上结果表明,293T-CP70Dc复合物具备开发为安全、高效的非病毒基因载体的潜力。2.利用与靶细胞同源的细胞膜“包衣”PEI70k/DNA复合物,实现基因的靶向递送。使用293T、Hep G2和He La三种细胞膜,通过挤压法制备相同质量比的293T-C P70Dc、Hep G2-CM/PEI70k/DNA capsule（简称Hep G2-CP70Dc）和He La-CM/PEI70k/DNA capsule（简称He La-CP70Dc）复合物。体外摄入和转染结果显示,三种复合物均在其同源细胞中表现出最高的摄入和转染效率,而在异种细胞中效率相对较低。安全性结果显示,三种复合物在三种细胞中均表现出较低水平的细胞毒性,且在其同源细胞中表现出一定程度上的安全性优势。此外,我们进一步提取了三种细胞的胞外基质（Extracellular matrix,ECM）,探究其对复合物靶向性的影响。结果显示,在加入同源细胞的ECM后,相较于异种细胞而言,三种复合物在其同源细胞中的摄入和转染效率进一步提高。综上所述,细胞膜“包衣”PEI/DNA复合物有望开发为一种安全、高效且具有靶向性优势的基因递送系统。
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