论文部分内容阅读
在生物体蛋白质生物合成后,蛋白质的共价修饰和酶促修饰称为翻译后修饰。ADP-核糖化是向蛋白质中添加一个或多个ADP-核糖部分。这是一种可逆的翻译后修饰,涉及细胞信号传导,DNA修复,基因调控和细胞凋亡等多种细胞过程。它由多聚核糖聚合酶(PARP)家族催化。一旦DNA发生损伤,多聚核糖聚合酶家族会被招募至DNA损伤位点,并将NAD+供体上共价连接的ADP-核糖部分转移到特异性氨基酸残基,比如天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸等侧链上。多聚ADP-核糖(PAR)链可以作为一种DNA损伤修复蛋白的信号,当DNA损伤修复完成后,PAR链就会被PAR链会被糖苷水解酶降解。蛋白的ADP-核糖基化在多种生物过程中(尤其DNA损伤修复)起重要作用。最近研究表明:丝氨酸是一个ADP-核糖基化重要的受体,并且丝氨酸的ADP-核糖基化被ADP-核糖水解酶3(ARH3或ADPRHL2)水解。然而,ARH3介导丝氨酸-ADP-核糖基化水解的具体机制尚不清楚。本论文中,通过克隆人源ARH3(19-363)的基因,构建p ET15b的重组基因,利用原核表达系统,经一系列纯化步骤得到浓度较高、均一性较好的重组蛋白并结晶、收集高分辨率晶体衍射数据、解析晶体结构,从而得到ARH3和ADPR复合物的结构。相关数据分析表明:在人源ARH3中有一组酸性氨基酸与催化中心的两个镁离子进行配位,作用于丝氨酸连接的ADP核糖基团的水解。特别是,还在催化中心发现了41位的谷氨酸的动态构象变化。这表明镁离子和Glu41及351位的水分子可能在丝氨酸-ADPR底物中介导了糖苷键的水解。此外,通过结构分析,发现ADPR被包裹在一个活性口袋中,并且和ARH3氨基酸的主链及侧链形成许多氢键,构成一个氢键网络。基于这些结构的发现,采用定点突变实验来探究ARH3结构中催化口袋上的关键氨基酸功能上的作用,进一步说明丝氨酸在介导DNA损伤修复上参与ADP-核糖基团的水解。不仅如此,ADPR的识别能够把ARH3招募到DNA损伤部位,这对DNA损伤应答修复十分重要。本论文将综合运用结构生物学及细胞生物学,分子生物学的知识技术手段,对ARH3从丝氨酸水解ADPR-核糖基团并引发DNA损伤修复的分子机制进行初步探究。