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神经元作为神经系统的基础结构和功能单元之一,神经元相互间的信息交流是大脑行使功能所必需的,按照神经元的作用能够分为兴奋性神经元和抑制性神经元。在大脑中,锥体神经元和中间神经元是两类最重要的神经元,二者相互协调神经元的活动和放电对生物体的行为表现至关重要。其中,锥体神经元的神经递质是谷氨酸,属于兴奋性神经元;而中间神经元则是以γ-氨基丁酸(GABA)为神经递质是主要的抑制性信号来源。中间神经元在维持大脑的兴奋性和抑制性平衡(excitation/inhibition balance,E/I balance)中发挥重要作用,而E/I balance的破坏被认为是导致如癫痫(Epilepsy)、精神分裂症(Schizophrenia)以及自闭症(Autism Spectrum Disorder)等许多神经精神疾病的主要原因之一。神经调节蛋白1(Neuregulin1,NRG1)及其受体(Erb B4)的编码基因已被鉴定为精神分裂症、双相情感障碍(Bipolar Disorder)和抑郁症(Major Depressive Disorder)等精神疾病的易感基因。Erb B4属于跨膜的酪氨酸激酶受体家族,其胞外结构域(Extra-cellular domain,ECD)与NRG1结合后,形成二聚体,引起胞内结构域(Intra-cellular domain,ICD)中酪氨酸激酶的自磷酸化而被激活,进而引发胞内下游信号通路级联响应。在出生后或成年的大脑中,Erb B4非常特异性地表达在抑制性中间神经元,NRG1/Erb B4信号通路调节成年大脑GABA能突触传递。抑制性突触是中间神经元与其他神经元联系的结构基础,在抑制性神经环路的装配中十分关键。突触形成的细胞和分子机制已被大量研究,很多调节兴奋性突触形成的细胞黏附分子也已经被发现和证实,然而对于抑制性突触形成的分子机制却并不明确。有研究表明,中间神经元中的Erb B4对于锥体神经元上GABA能突触的形成和维持具有促进作用,但其中是否需要Erb B4的激酶活性仍不清楚。为此,我们首先在体外通过人工突触形成实验(artificial synapse formation assay),将HEK293T细胞(人胚胎肾293T细胞)与原代海马神经元共培养,利用免疫细胞化学染色观察HEK293T中过表达的蛋白对神经元中抑制性突触后标志物gephyrin聚集的诱导,从而反映锥体神经元上抑制性突触的形成。我们发现表达Erb B4的HEK293T细胞能够诱导gephyrin聚集的形成,但表达Erb B4-K751M(Erb B4第751位赖氨酸突变为甲硫氨酸,导致Erb B4酪氨酸激酶活性失活)突变体的HEK293T细胞也能够诱导gephyrin聚集,提示Erb B4诱导锥体神经元上GABA能突触的形成并不依赖Erb B4酪氨酸激酶活性。为了在体内证实,我们构建了Erb B4-K751M基因敲入(knockin)小鼠。对比对照野生型(WT)小鼠,中间神经元的数量以及锥体神经元上抑制性突触的数目在K751M小鼠脑中均不发生改变,但在Erb B4缺陷(Null)小鼠中都明显减少。接下来,为了探索Erb B4如何调节锥体神经元的GABA能突触的形成,我们在体外HEK293T细胞中利用细胞聚集(cell aggregation assay)和免疫共沉淀实验,发现Erb B4通过其ECD中的RLD结构域与抑制性突触后跨膜粘附分子Slitrk3结合,并且是一种反式(in trans)跨细胞间的结合。在人工突触形成实验中,HEK293T细胞表达Erb B4缺失RLD结构域的突变体无法诱导gephyrin聚集;进一步在原代神经元中过表达可分泌的RLD结构域破坏Erb B4-Slitrk3结合后,gephyrin聚集减少。最后,我们在体外表达纯化RLD结构域,并利用立体定位注射至K751M小鼠海马,以及电生理检测发现抑制Erb B4与Slitrk3的结合降低了CA1区锥体神经元GABA能突触传递。我们这些结果表明Erb B4可以不依赖于其酪氨酸激酶活性,而作为一个细胞粘附分子与Slitrk3反式结合,从而促进兴奋性神经元上GABA能突触的形成,这为Erb B4在抑制性突触中的形成提供了新的分子机制。Perineuronal nets(PNNs)是中枢神经系统中一类特化的细胞外基质,主要包裹着GABA能中间神经元的胞体、近端树突和轴突起始端,在海马和皮层分布很高,与很多不同的大脑功能有关。PNNs的损伤会导致认知、学习和记忆等多种行为学的改变,临床上也发现PNNs在多种精神疾病中显著下降。但目前对于PNNs形成的分子调控机制以及PNNs如何影响神经元的功能却十分不清楚。首先为了探索神经元活动是否影响PNNs,我们建立了小鼠丰富环境(environmental enrichment)的模型以增强小鼠神经元活动,通过Y迷宫(Y-maze)和新物体识别(novel object recognition test)等行为学检测发现该模型下小鼠的空间工作记忆和认知能力增强,并且前额叶皮层(m PFC)的PNNs表达增加。而对m PFC注射软骨素酶ch ABC成功消化PNNs后,小鼠的空间工作记忆和认知能力受损。同时我们也观察到丰富环境模型下的小鼠m PFC中NRG1和Erb B4表达增加,并且Erb B4酪氨酸激酶磷酸化水平也提高,表明丰富环境促进了NRG1-Erb B4的信号通路。接下来为了探究NRG1/Erb B4信号通路对PNNs形成的影响,我们在体外对培养的神经元加入NRG1进行处理,发现NRG1可以促进Erb B4阳性神经元上PNNs的表达,并且该促进作用能够被Erb B4酪氨酸激酶的抑制剂所抑制,说明NRG1-Erb B4信号通路可以促进PNNs的表达和形成。最后,为了在体内检测,我们利用可诱导型Erb B4敲除(Erb B4-i KO)小鼠和Erb B4-T796G(Erb B4第796位苏氨酸突变为甘氨酸,该突变并不改变Erb B4酪氨酸激酶活性,但可以特异性被化学抑制剂1NMPP1结合而抑制其酪氨酸激酶活性)knockin小鼠,发现在成年期敲除Erb B4或抑制Erb B4酪氨酸激酶活性后,小鼠皮层PNNs的表达和形成均明显减少,并且小鼠的空间工作记忆和认知能力也都降低。总之,通过体外原代神经元培养和体内基因工程小鼠实验,我们首次发现NRG1/Erb B4信号通路调节PNNs的形成,进而可能影响小鼠的行为。综上所述,Erb B4作为一个在抑制性中间神经元特异性表达的单次跨膜酪氨酸激酶受体,不仅仅可以只依赖于ECD通过细胞粘附作用,介导抑制性突触在锥体神经元上形成;也可以通过经典的NRG1/Erb B4信号通路而促进GABA能中间神经元周围PNNs的形成。Erb B4的这些作用不但调控中间神经元功能的发挥,而且影响整个大脑的抑制性神经环路,进而调节生物体的行为。